荧光光谱法在蛋白质研究中的应用_尹燕霞

1、荧光光谱法在蛋白质研究中的应用尹燕霞,向本琼,佟丽(北京师范大学生命科学学院,北京100875摘要:荧光光谱法对研究蛋白质结构及其构象变化是很重要的。描述了荧光光谱的概念、发光机理及特点,介绍了荧光光谱仪的仪器原理和结构,记述了荧光光谱技术在检测蛋白质的构象变化、蛋白质的含量和酶活性方面的具有应用。关键词:荧光光谱法;蛋白质;构象中图分类号:O 657.3;T Q937文献标志码:A 文章编号:1002-4956(201002-0033-04The application of studying fluorescence spectroscopy on proteinYin Yanxia ,X

2、iang Benqio ng ,Tong Li(College o f Life Science ,Beijing N or mal U nive rsity ,Beijing 100875,China A bstract :F luore scence spectro sco py is ve ry impor tant for studying pro tein structure and co nfo rmatio n changes .T he co ncept and principle of f luore scence spectroscopy a re intro duced

3、at first ,then the applicatio n o f studying fluor escence spectro scopy o n pr otein is ex plained .Key words :f luore scence spec troscopy ;pro tein ;co nf orma tion 收稿日期:2009-05-25基金项目:“生物化学大实验校级精品课”建设项目及“生命科学创新人才实验教学体系建设与改革”教改项目(127016作者简介:尹燕霞(1978,女,山东省泰安市人,硕士,实验师,主要从事:生物化学与分子生物学实验教学.1荧光光谱技术某些物

4、质被一定波长的光照射时,会在较短时间内发射出波长比入射光长的光,这种光称为荧光。荧光光谱在各方面的应用及有关的方法称为荧光光谱技术。1.1荧光发光机制每一个分子具有一系列分离的电子能级,每一电子能级中又有一系列的振动能级和转动能级。当物质被光照射后,大约在10-15s 内光被物质吸收,物质分子获得能量,分子内的电子跃迁到较高能级而变成激发态。处于激发态的分子很不稳定,它首先通过内转换将部分能量转移给周围分子,回到最低电子激发态振动能级(称为第一级电子激发态振动能级,处于这一能级的分子平均寿命大约是10-8s ,如果这时分子通过发射相应的光量子来释放剩余能量而回到基态的各个不同的振动能级,就产生

5、了荧光。因此,最低第一级电子激发态振动能级是产生荧光的基础。由于分子发射荧光前已有一部分能量被消耗,所以荧光能量要比物质吸收的光能量小,因而荧光的发射波长总比激发波长长。图1荧光产生机理1.2常用荧光参数荧光光谱包括激发光谱和发射光谱两种。激发光ISS N 1002-4956CN11-2034/T 实验技术与管理E xperim ental Technology and M anagem ent 第27卷第2期2010年2月Vol .27No .2Feb .2010谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况;发射谱则是在某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长

6、处的分布情况。在发射谱中最大荧光强度对应的荧光波长称为最大荧光波长,记为max,它是荧光光谱的一个重要参数,对环境的极性和荧光团的运动很敏感。为了有利于测定,一般都选择激发光谱的峰位测定发射光谱,选择发射光谱的峰位测定激发光谱1。激发光谱与发射光谱呈镜象对称关系。荧光强度是最常用的参数,与很多因素有关,可用下列公式表示:F=K0(1-c-b c式中:F是荧光强度;K是仪器常数;是量子产率;0是激发强度;是摩尔吸收系数;b是荧光池的光径;c 是荧光物质溶液的浓度。当溶液很稀时,上式可简化为F=K0bc=K0A式中A为光吸收值,A=bc。可知,在低浓度下,样品浓度和荧光强度呈线性关系。利用此公式,

7、可用荧光光谱法测定荧光物质,如氨基酸、蛋白质含量。量子产率表示荧光物质发射荧光的本领,用表示。其定义为发射的光量子数与吸收的光量子数之比,又称荧光效率或量子效率。若两种溶液测量条件完全相同,则可用相对法测定:1/2=F1A2/F2A1,F是荧光强度,A为光吸收值。量子产率的改变必然会引起荧光强度的改变。因此,如果要研究量子产率的相对值,只要测量荧光强度也就足够。2荧光光谱仪原理及结构能发射荧光的物质称为荧光物质。测定荧光光谱的仪器称荧光光谱仪,其结构上的最主要特点是入射的激发光与荧光探测方向垂直。其工作原理是由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中,激发样品中的荧光物质发出荧

8、光,荧光经过滤和反射后,被光电倍增管接受,然后以图或数字的形式显示出来。图2是本实验室的Fluo ro Max-2荧光光谱仪示意图。仪器主要由光源、激发单色器、发射单色器、样品池、检测器以及显示系统组成。荧光光谱仪常用光源有钨灯、氢灯、氘灯、汞灯、激光灯等,紫外光源用得最多。氙灯在200800nm范围内具较好的发射光谱。汞灯是校准用光源。单色器用来选择特定波长的单色光入射到样品上。检测器一般用光电管或光电倍增管,将光信号放大并转为电信号。荧光光谱仪的样品池是四面透光的石英杯,且用去荧光石英材料制成,它可以作为紫外分光光度计的样品池。测量液体时,光源与检测器成直角安排。紫外分光光度计的样品池是两

9、面透光的样池,它不能作为荧光光谱仪的样品池。发射光单色器或称第二单色器放在样品池和检测器之间,其作用是让被测样品所发生的荧光透过,而滤去由激发光所发生的反射光、闪射光,也就是用来选择一定波长的光进入检测器测量。计算机辅助记录系统用以完成绘图及荧光强度的测量 。图2荧光光谱仪示意图3蛋白质的内源荧光与荧光探针利用荧光光谱法研究蛋白质,一般有两种方法。一是测定蛋白质分子的自身荧光(内源荧光,另一种是当蛋白质本身不能发射荧光时,通过非共价吸附或共价作用向蛋白质分子的特殊部位引入外源荧光(也称荧光探针,然后测定外源荧光物质的荧光。3.1蛋白质的内源荧光含有芳香族氨基酸(色氨酸(trptophan,Tr

10、p、酪氨酸(ty rosine,Ty r和苯丙氨酸(pheny lalanine, Phe残基的蛋白质在280nm或295nm的激发光的激发下会产生荧光,这种荧光称为内源性荧光(天然荧光。蛋白质荧光来自于Trp、Ty r以及Phe,其荧光光谱对环境极为敏感,成为研究蛋白质的结构、折叠动力学以及蛋白质分子间相互作用的一种理想选择。T rp、Tyr和Phe由于其侧链生色基团的不同而有不同的荧光光谱。其荧光峰位波长分别是348、303、282nm,其中T rp的荧光强度最大,而Phe的荧光强度则很低,因此蛋白质的内源荧光主要是由Trp和Tyr残基形成的。同时在含有Trp和Tyr的蛋白质中,由于其分子

11、发生了从Ty r残基到Trp残基的能量转移,从而导致Ty r残基的荧光猝灭和Trp残基的荧光增加,因而Trp最常被用作内源探针来研究蛋白质的结构。34实验技术与管理3.2蛋白质的外源荧光现在常用外源荧光光谱法来测定蛋白质的疏水微区、二基团之间的距离以及酶与底物结合过程中的蛋白质构象变化等。所谓外源荧光光谱法就是利用小分子荧光化合物与其荧光较弱或不发荧光的物质共价或非共价结合,形成发强荧光的络合物,然后,测定络合物的荧光。常用测定蛋白质的荧光探针主要有丹磺酰氯、荧光胺、1-苯胺基萘-8-磺酸(1-anilinonaphthalene-8-sulfo nate,ANS、2-对甲苯胺基萘-6-磺酸(

12、2-p-to luidinonathalene-6-sulfonate,TNS、1-(N-二甲基胺-萘-5-磺酸(1-(N-dimethy lamino-naphthalene-5-sulfo nate,DNS等。4荧光光谱法在蛋白质研究中的应用4.1利用蛋白质的天然荧光检测蛋白质的构象变化利用蛋白质中的芳香族氨基酸残基的侧链基团具有吸收紫外区域的入射光从而发射荧光的特性,来研究蛋白质在变性或复性过程中整体空间构象的变化。其基本机理是:荧光来源于生色团基团在不同电子能级之间的跃迁,荧光频率取决于能级之间的能量差,生色团基团与周围基团的相互作用可能会改变其处于激发态时所具有的能量,从而改变其发射

13、荧光的频率与强度。同一种荧光分子在不同极性的环境中,其最大吸收波长可能会有所差别。一般来说,极性环境会影响生色团基团的基态和激发态能级,减少激发态的能量,从而引起发射谱的红移(使max增大。在天然的蛋白质中,可产生荧光的芳香族氨基酸分子多处于蛋白质的内部,被多种非极性氨基酸残基包围,因此其所处的局部小环境的极性弱于蛋白质分子外部水溶液的极性。蛋白质变性过程中,芳香族氨基酸分子的侧链基团逐渐暴露于水溶液中,其所处的环境极性逐渐增加,因此蛋白质荧光发射峰的max逐渐增大。max红移的程度可以反映蛋白质构象变化的程度,红移程度越大,则表明蛋白质在变性过程中构象变化的程度越大。反过来,蛋白质复性过程中

14、,芳香族氨基酸分子的侧链逐渐内埋于蛋白质内部,其所处的环境极性逐渐降低,因此蛋白质荧光发射峰的max逐渐减小,称为max的蓝移。通过测定蛋白质max蓝移的程度,可以推算其整体构象变化的程度。图3是本科生物化学实验教学中学生用荧光光谱来研究大肠杆菌碱性磷酸酶在8 mol/L尿中不同变性时间下的光谱图,可以看出,最大发射波长向长波方向移动,从333nm红移到354 nm(红移,说明酶的构象在发生改变,酶正在发生变性,且随着变性时间的增加,红移程度越大,表明构象变化的程度越大。图4是尿变性后的碱性磷酸酶在不同复性时间下的光谱图,整体趋势与变性时相反,最大波长向短波方向移动,说明蛋白质的构象在发生一定

15、的变化,松散的结构逐步折叠组装成高级结构,蛋白在发生复性,且随着复性时间的增加,蓝移程度越大,表明碱性磷酸酶的构象逐渐恢复到天然构象状态 。图3 碱性磷酸酶变性过程中内源荧光光谱的测定图4碱性磷酸酶复性过程中内源荧光光谱的测定4.2利用荧光探针检测蛋白质的构象变化由于荧光探针的荧光光谱对环境变化十分敏感,因此它对蛋白质分子的构象变化也就十分敏感。例如用ANS做荧光探针的时候,它通过非共价结合到蛋白质分子的非极性区域中时,其荧光光谱会随着所处环境非极性的增加而发生蓝移,且荧光强度也随之提高,最大吸收/发射在375/500nm,在一定范围内,荧光强度与蛋白质的浓度呈线性关系。利用ANS的这个性质,

16、可以衡量ANS结合的蛋白质部位的极性的变化,根据极性的变化又可以进一步推测蛋白质结构的变化。用A NS标记钙调蛋白磷酸酶B亚基(calci-neuring B subunit,CNB,在有钙离子存在时的荧光光谱与没有钙离子时相比有明显变化,表明钙离子的存在会引起CNB构象的变化2。4.3测定蛋白质的含量利用蛋白质的内源荧光,可以检测蛋白质的含量,35尹燕霞,等:荧光光谱法在蛋白质研究中的应用其基本原理与紫外-可见分光光度法相仿,但灵敏度高于紫外吸收法。主要有标准曲线和内标法两种。标准曲线法是在同样条件下,以已知量的标准荧光蛋白质配成不同浓度的标准溶液,将在荧光光谱仪上测得的值绘成标准曲线,然后

17、再测未知样品值,利用标准曲线求出荧光物质的含量。内标法通常是在一定的浓度范围内,选择合适的标准蛋白溶液浓度,将其在荧光光谱仪上测得的值与在同样条件下测得的未知样品的值比较,计算求出未知样品的浓度。蛋白质中伯胺还可以与荧光胺反应生成发荧光的化合物,其荧光强度与蛋白质的含量成正比,因而可利用荧光胺测定蛋白质的含量,但也必须预先测定已知浓度的标准蛋白溶液的荧光强度3。4.4测定酶的活性荧光光谱法是测定酶活性的一种方法,主要是根据底物或产物的荧光性质的差别来进行测定,其灵敏度要比紫外及可见分光光度法高若干个数量级,而且荧光强度与激发光的光源有关,因此在酶活性的测定中越来越多地被采用,特别是用于一些快速

18、反应的测活性场合。荧光光谱法的一个缺点是易受其他物质干扰。例如酶本身的内源荧光的干扰。故用荧光法测定酶活力时,尽可能选择酶的内源荧光较弱的可见光范围进行测定。如乳酸脱氢酶(lac-tate dehydrogenase,LDH的活性测定,乳酸脱氢酶可催化乳酸与氧化态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nico-tinamide adenine dinucleo tide,NAD+的反应,NAD+被还原为原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adinine dinucleotide,NADH,NADH能被强碱转换成荧光化合物,则可以测定其荧光强度,用于度量乳酸脱氢酶的活性。4.5研究小分子与蛋白质

19、间的相互作用荧光光谱法是研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段。在相互作用研究中常采用荧光猝灭法,荧光猝灭是指由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象。荧光猝灭法分为动态猝灭和静态猝灭两种方式,其具体理论参见陈国珍的有关论著4。荧光猝灭法多用于研究生物大分子,如蛋白质与小分子药物或金属离子的相互作用,可引入外源性荧光作为探针,也可利用蛋白质自身的内源性荧光。借助荧光猝灭法可测得药物分子与蛋白质的结合常数及结合点数,再依据Forster能量转移机制可求出供体与受体间的结合距离及能量转移效率5。该法应用十分广泛6-8,且常与紫外可见吸收光谱法及圆二色谱法一起

20、使用,相互验证。5蛋白质荧光光谱研究的一些新方法5.1同步荧光光谱同步荧光技术是在同时扫描激发和发射波长的情况下来测绘荧光光谱图。由测得的荧光强度信号对激发或发射波长作图,即为同步荧光光谱。它包括固定波长的和固定能量的同步荧光两种光谱。固定波长的同步荧光光谱是在同步扫描中,激发波长em和发射波长ex保持固定的波长间距(=em-ex,即在为常数的情况下扫描,以同步荧光信号对发射或激发波长测绘荧光光谱图9。固定能量的同步荧光光谱是指在同步扫描过程中,是激发波长与发射波长之间保持着固定的能量差,即使得波数差=(1/ex-1/em×107(cm-1为常数10。在构成蛋白质的20种氨基酸中,仅

21、有芬香族氨基酸Trp、Ty r、Phe是发荧光的基团,但由于三者在普通荧光光谱中的激发光谱和发射光谱相互重叠,不能同时测定,给研究蛋白质的工作带来困难。采用固定波长的同步扫描时,由< 15nm所得到的同步光谱显示Ty r的光谱,而> 60nm的同步光谱,则呈现Trp的光谱特征11,选用=55nm进行同步扫描,则可同时测定Ty r、Trp、Phe残基的发射光谱12。5.2三维荧光光谱法三维荧光光谱是由激发波长(Y轴、发射波长(轴和荧光强度(轴三维坐标所表征的矩阵光谱,也叫总发光光谱。该技术可获得激发波长与发射波长同时变化的荧光强度信号,它能较直观地表明Trp残基在蛋白质分子中的微环境

22、及其在不同条件下的构象变化13。5.3荧光共振能量传递分析荧光共振能量转换(fluorescence resonance energy transfer,FRET是指两个荧光受色基团足够近时,供体分子吸收一定频率的光子后,被激发到更高的电子态,在回到基态前,通过偶极子相互作用实现能量向邻近的受体分子转移。FRET由两部分组成:镧系元素螯和物为能量供体,有机探针为受体。FRET是进行结合分析(抗体-抗原;受体-配体,肽-蛋白或蛋白-蛋白激酶分析的理想工具。此中分析基于两种标记:能量供给长时间衰减螯和物标记;短时间衰减有机接受体。当标记物被带到非常接近结合反应时能量转移发生。根据记录接收体的时间分

23、辨荧光量来检测转移的能量。6结束语荧光光谱法是研究蛋白质结构和构象的一种有效方法,常与圆二色光谱、吸收光谱、核磁共振、电子自旋(下转第40页 图5虚拟电子秤组成应变片传感器使用前面实验中用到的装置。调理电路采用直流电桥,电桥的形式由学生自己选择,采用仪表放大电路进行电压信号调理。数据采集模块可由提供的3种不同总线板卡和4种串口通信形式中任选。最后,在使用LabVIEW 软件完成虚拟电子秤的功能设计和前面板规划。4.2电机转速检测与控制电机转速检测与控制是一个典型的单入单出自动控制系统8,通过这个实验项目的学习,学生可以接触到计算机控制系统的各个环节和内容。图6为电机转速检测与控制的组成框图 。

24、图6电机转速检测与控制组成该实验项目的控制对象选用原有的直流电机,传感器采用GK405,频压转换电路可采用前面提到的电路。学生需要使用LabVIEW 软件测量转速并完成PID 控制器的编写。5结束语提高实验部分没有规划实验课时,学生可以在课外时间进实验室进行相关内容的学习。检测技术实验室自主类实验项目的设计与建设已经全部完成,经过一个学期的运行,新实验项目激发了学生实验的积极性和主动性,学生反映良好,基本达到了预期目标。本实验项目的开发是在现有模式和条件下积极改善实验教学效果的一种尝试。参考文献(References :1孙建民,杨清梅.传感器技术M .北京:清华大学出版社,2007.2曹才开

25、.检测技术与应用M .长沙:中南大学出版社,2009.3孔德仁.工程测试技术M .北京:科学出版社,2009.出版社,2005.5赛尔吉欧·佛朗哥.基于运算放大器和模拟集成电路的电路设计M .3版.西安:西安交通大学出版社,2004.6侯国屏,王坤,叶齐鑫.Lab VIEW 7.1编程与虚拟仪器设计M .北京:清华大学出版社,2005.7杨乐平,李海涛,杨磊.Lab VIEW 程序设计与应用M .2版.北京:电子工业出版社,2005.8高金源.计算机控制系统M .北京:高等教育出版社,2003.(上接第36页共振波谱等技术互相补充,给出更全面的数据和结果,成为蛋白质及生命科学研究中的

26、有利工具。参考文献(References :1陶慰孙,姜涌明.蛋白质分子基础M .北京:高等教育出版社,1995.2Jiang Guohua ,W ei Qun ,Fu nction and structure of N -termianl an dC -termiandl d om ain s of calcineurin B sub unit J .Biol Chem ,2003,384(9:1299-303.3王炜,廖国宁,季金林,等.荧光微量检测细胞内DNA 与蛋白质含量J .1999,28(3:267-272.4陈国珍.荧光分析法M .北京:科技出版社,1990.5Lakow icz J R .Principles of fluorescence spectroscopy M .NewYo rk :Plenum Press ,1983.6王峰,黄薇,唐波,等.蒂巴因与牛血清白蛋