荧光光谱知识

1、荧光光谱教程一、化学发光反应的类型1直接化学发光和间接化学发光化学发光反应可分直接发光和间接发光。直接发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。表示如下：式中A或B是被测物，通过反应生成电子激发态产物C*，当C*跃迁回基态时，辐射出光子hv。 间接发光是被测物A或B通过化学反应后生成初始态C*，C*不直接发光，而是将其能量转移给F，使F处于激发态，当F*跃迁回基态时，产生发光。如下式表示 式中C*为能量给予体，而F为能量接受体。例如，用罗丹明B没食子酸的乙醇溶液测定大气的O3，其化学发光反应就属这一类型。 没食子酸被O3氧化时吸收反应所产生的化

2、学能，形成受激中间体A*，而A*又迅速将能量转给罗丹明B，并使罗丹明B分子激发，处于激发态的罗丹明B分子回到基态时，发射出光子。该光辐射的最大发射波长为584nm。2. 气相化学发光和液相化学发光按反应体系的状态来分类，如化学发光反应在气相中进行称气相化学发光，在液相或固相中进行称液相或固相化学发光，在两个不同相中进行则称为异相化学发光。本节主要讨论气相和液相化学发光，其中液相化学发光在痕量分析中更为重要。（1）气相化学分光主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、NO2、H2S、SO2和CO等。 臭氧与乙烯的化学发光反应机理是O3氧化乙烯生成羰基化合物的同时产生化学发

3、光，发光物质是激发态的甲醛。这个气相化学发光的最大波长为435nm，发光反应对O是特效的，线性响应范围为1ng·mL-11g·mL-1。 一氧化氮与臭氧的气相化学发光反应有较高的化学发光效率，其反应机理为：这个反应的发射光谱范围为600875nm，灵敏度可达1ng·mL-1。若需同时测定大气中的NO2时，可先将NO2还原为NO，测得NO总量后，从总量中减去原试样中NO的含量，即为NO2 的含量。 SO2、NO、CO等都能与氧原子进行气相化学光反应，他们的反应分别为：此反应的最大发射波长为200nm，测定灵敏度可达1ng·mL-1。 发射光谱范围为4001

4、400nm，测量灵敏度可达1ng·mL-1。 发射光谱范围为300500nm，测定灵敏度可达1ng·mL-1。这些反应的关键是要求有一个稳定的氧原子源，一般可由O3在1000的石英管中分解为O2和O而获得。 火焰化学发光，氮的氧化物（如NO2、NO等）及挥发性的硫化物（如SO2、H2S、CH3SH等）富氢火焰中燃烧都会发生化学发光。（2）液相化学发光用于这一类化学发光分析的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉碱等，其中鲁米诺（Lominol）化学发光反应机理研究得最久，其化学发光体系已用于分析化学测量痕量的H2O2以及Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg和Th等金属离子。

5、鲁米诺是3-氨基苯二甲酰肼，它产生化学发光反应的 为0.010.05。鲁米诺在碱性溶液中形成叠氮醌（a），叠氮醌在碱性溶液中与氧化剂如H2O2作用生成不稳定的桥式六员环过氧化物中间体（b）。然后再转化为激发态的氨基邻苯二甲酸根离子（c），其价电子从第一电子激发态的最低振动能级层跃迁回基态中各个不同振动能级层时，产生最大发射波长为425nm的光辐射，整个反应历程可表示如下：以上的化学发光反应的速率很慢，但某些金属离子（如在本节开始所提到的金属离子）会催化这一反应，增强发光强度。利用这一现象可以测定这些金属离子。还可将分析物通过酶的转化，生成化学发光反应物，然后再进行化学发光反应，根据化学发光强度

6、间接测定被分析物。例如，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下进行氧化反应，反应产物H2O2可通过鲁米诺化学发光反应进行测定，从而间接测定葡萄糖。 氨基酸的测定也一样：H2O2使鲁米诺发光。如果使酶促反应的底物浓度一定，则上述反应可用于酶测定或酶动力学研究。下表中给出其他用于液相化学发光反应的发光试剂： 俗名洛粉碱（Lophine）光泽精（Lucigenin）没食子酸（）系统命名2,4,5三苯基咪唑N,N二甲基二丫啶硝酸盐焦性没食子酸（）结构式二、化学发光的基本原理某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发到激发态，受激分子由激发态去激化跃迁回基态时以辐射形式发射出一定

7、波长的光。这种吸收化学能使分子激发并发光的过程，称为化学发光。利用化学发光建立起来的分析方法称为化学发光分析法。化学发光也发生在某些生物体系内，称为生物发光。化学发光分析法的特点是，灵敏度高，选择性好，仪器设备简单，分析速度快。但是目前可供发光用的试剂还不多，应用还有限，发光机理有待进一步研究。化学发光是基于化学反应所提供的化学能使分子激发而发射光的，任何一个化学发光反应都包含有化学激发和发光两个关键过程，它必须满足下列条件：1化学反应必须提供足够的激发能，激发能的主要来源是反应焓，能在可见光范围内发生化学发光的物质，其激发能E通常是在150400KJ·mol1范围。许多氧化还原反应

8、的反应焓与此相当，因此大多数化学发光反应为氧化还原反应。2要有有利的化学反应历程，使反应产生的化学能用于不断地产生激发态分子。对于有机化合物的液相化学发光来说，芳香族化合物和羰基化合物更容易生成激发态的产物。3激发态分子跃迁回基态时，要能释放出光子，或激发态分子能将能量转移给另一种分子，使该分子受激后发射光子。总之，激发态分子不能以热的形式损失能量。化学发光反应的化学发光效率，又称为化学发光的总量子产率。它决定于生成激发态产物分子的化学激发效率和激发态分子的发射效率。定义为：化学反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由参加反应物质的化学反应所决定。每一个化学发光反应都有其特征的化学

9、发光光谱及不同的化学发光效率。 化学发光反应的发光强度ICl以单位时间内发射的光子数表示，它与化学发光反应的速率有关，而反应速率又与反应分子浓度有关。可以下式表示：式中表示t时刻的化学发光强度，是与分析物有关的化学发光效率，dc/dt是分析物参加反应的速率。如果反应是一级动力学反应，t时刻的化学发光强度与该时刻的分析物浓度成正比，就可以通过检测化学发光强度来定量测定分析物质。在化学发光分析中通常用峰高表示发光强度，即峰值与被分析物浓度成线性关系。另一种分析方法是利用总发光强度与分析物浓度的定量关系。就是在一定的时间间隔里对化学发光强度进行积分，得到：如果取t1=0，t2为反应结束所需的时间，则

10、得到整个反应产生的总发光强度，它与分析物浓度存在线性关系。三、化学发光分析的应用化学发光分析最大的特点是灵敏度高，对气体和痕量金属离子的检出限都可达ng·mL1级。在环境检测中化学发光法比吸收光谱法和微库仑法具有更高的灵敏度，又能进行快速连续分析，因此气相化学发光反应已广泛用于空气中有害物质如O3、氮氧化物、CO、SO2、H2S等的监测。其测定灵敏度可达13ng·mL1。液相化学发光反应，如鲁米诺、光泽精、没食子酸等发光体系可测定天然水和废水中的金属离子。在医学、生物学、生物化学和免疫学研究中，化学发光分析也是一种重要的手段。表4.84.10列举了一些实例。四、荧光和磷光分

11、析法的基本原理第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，他于1575年提到，在含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现出极为可爱的天蓝色。以后逐步有一些学者也观察和描述过荧光现象，但对其本质及含义的认识都没有明显的进展。直到1852年，对荧光分析法具有开拓性工作的Stokes在考察奎宁和绿色素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，而不是由光的漫反射引起的，从而导入荧光是光发射的概念，并提出了“荧光”这一术语，他还研究了荧光强度与荧光物质浓度之间的关系，并描述了在高浓度或某些外来物质存在时的荧光猝灭现

12、象。可以说，他是第一个提出应用荧光作为分析手段的人。1867年，Goppelsr?de应用铝一桑色素配位化合物的荧光测定铝，这是历史上首次进行的荧光分析工作。进入二十世纪以来，荧光现象被研究得更多了，在理论和实验技术上都得到极大的发展。特别是近几十年来，在其他学科迅速发展的影响下，随着激光、计算机和电子学的新成就等一些新的科学及技术的引入，大大推动了荧光分析法在理论上及实验技术上的发展，出现了许多新的理论和新的方法。在我国，二十世纪五十年代初期仅有极少数的分析工作者从事荧光分析方面的研究工作。到了七十年代以后，已逐步形成一支在这个研究领域中的工作队伍。目前，研究内容已从经典的荧光分析方法扩展到

13、新近发展起来的一些新方法和新技术。磷光也是某些物质在紫外光照射下所发射的光，早期并没有与荧光明确的区分。1944年Lewis和Kasha提出了磷光与荧光的不同概念，指出磷光是分子从亚稳的激发三重态跃迁回基态所发射出的光，它有别于从激发单重态跃迁回基态所发射的荧光。磷光分析法由于其有某些特点，几十年来的理论研究及应用也不断得到发展。五、荧光和磷光的产生在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动能级。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)后被激发为激发态。激发态是很不稳定的，它将很快地释放出能量又重新跃迁回基态。若分子返回基态时以发射电磁辐射(即光)的形式释放能量，就称为“发光”。如

14、果物质的分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的电磁辐射，称为荧光和磷光。现从分子结构理论来讨论荧光和磷光的产生机理。每个分子中都具有一系列严格分立相隔的能级，称为电子能极，而每个电子能级中又包含有一系列的振动能级和转动能级。分子中电子的运动状态除了电子所处的能级外，还包含有电子的多重态，用M=2S+1表示，S为各电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1 。根据Pauli不相容原理，分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。若分子中所有电子都是自旋配对的，则S=0，M=1，该分子便处于单重态(或叫单重线)，用符号S表示。大多数有机化合物分子的基态都处于单重态。基态分子吸

15、收能量后，若电子在跃迁过程中，不发生自旋方向的变化，这时仍然是M=1，分子处于激发的单重态；如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化，这时分子中便具有两个自旋不配对的电子， 即S=1，M=3，分子处于激发的三重态，用符号T表示。图14.1为电子重态示意图。处于分立轨道上的非成对电子，自旋平行要比自旋配对更稳定些(洪特规则)，因此在同一激发态中，三重态能级总是比单重态能级略低。图14.2为能级及跃迁示意图，其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态；T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。V=0、1、2、3、表示基态和激发态的振动能级。图14.1  

16、;   单重态系三重态激发示意图图14.2     荧光和磷光体系能级图处于激发态的分子是很不稳定的，它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁的形式去活化(去激发)释放出多余的能量而返回基态。辐射跃迁主要涉及到荧光，延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁是指以热的形式释放多余的能量，包括振动弛豫、内部转移、系间跨越及外部转移等过程。图14.2表示分子激发和去活化的能量传递过程：1振动弛豫（Vibration relaxation，简写为VR）当分子吸收光辐射(为图14.2中的1、2)后可能从基态的最低振动能级(V=0)跃迁到激发单重态Sn(

17、如图中S1、S2)的较高振动能级上。然后，在液相或压力足够高的气相中，分子间的碰撞几率很大，分子可能将过剩的振动能量以热的形式传递给周围环境，而自身从激发态的高振动能级跃迁至该电子能级的最低振动能级上，这个过程称为振动弛豫。发生振动弛豫的时间为1012s数量级。2内部转移（Internal conversion，简写为IC）当高电子能级中的低振动能级与低电子能级中的高振动能级发生重叠时，常发生电子从高电子能级以无辐射跃迁形式转移至低电子能级。如图14.2中，S2和T2中的低振动能级与S1和T1中的高振动能级重叠，电子可以通过振动能级的重叠从S2跃迁至S1，或从T2跃迁至T1。这个过程称为内部转

18、移。内部转移的时间为1011s1013s数量级。振动弛豫及内部转移的速率比由高激发态直接发射光子的速率快得多，所以，分子吸收辐射能后不管激发到哪一个激发单重态，都能通过振动弛豫及内部转移而跃迁到最低(第一)激发单重态的最低振动能级。3荧光发射（Fluorescence emission，FE）处于激发单重态的电子经振动弛豫及内部转移后到达第一激发单重态(S1)的最低振动能级(V=0)后，以辐射的形式跃迁回基态(S0)的各振动能级，这个过程为荧光发射，发射的荧光波长为。由于经过振动弛豫和内部转移的能量损失，因此荧光发射的能量比分子吸收的能量要小，荧光发射的波长比分子吸收的波长要长，即。第一激发单

19、重态最低振动能级的平均寿命约为109104s，因此荧光寿命也在这一数量级。4系间跨跃（Intersystem Crossing，ISC）系间跨跃是指不同多重态之间的无辐射跃迁过程，它涉及到受激发电子自旋状态的改变。如由第一激发单重态S1跃迁至第一激发三重态T1，使原来两个自旋配对的电子不再配对。这种跃迁是禁阻的(不符合光谱选律)，但如果两个能态的能层有较大重叠时，如图14.2中S1的最低振动能级与T1的较高振动能级重叠，就有可能通过自旋一轨道耦合等作用实现这一跃迁。系间跨跃的速度较慢，经历的时间较长。5磷光发射（Phosphorescence emission，PE）激发态的电子经系间跨跃后到

20、达激发三重态，经过迅速的振动弛豫而跃迁至第一激发三重态的最低振动能级，然后以辐射形式跃迁回基态的各振动能级，这个过程为磷光发射。磷光发射的跃迁仍然是自旋禁阻的，所以发光速度很慢。磷光的寿命为104100s。因此，外光源照射停止后，磷光仍可持续一短时间。由于经过系间跨跃及T1 中振动弛豫丢失了一部分能量，所以磷光波长比荧光波长要长，即必须指出的是，T1还可能通过热激发而重新跃回S1 即T1S1，然后再由S1经辐射跃迁回S0，即S1S0，发出荧光，这种荧光称为延迟荧光，其寿命与磷光相近，但波长比磷光短。6外部转移（External convertion，EC）激发态分子与溶剂分子或其它溶质分子相互

21、碰撞，并发生能量转移的过程称为外部转移。外部转移能使荧光或磷光的强度减弱甚至消失，这种现象称为猝灭或熄灭。六、激发光谱和发射光谱荧光和磷光均属于光致发光，所以都涉及到两种辐射，即激发光(吸收)和发射光，因而也都具有两种特征光谱，即激发光谱和发射光谱。它们是荧光和磷光定性和定量分析的基本参数及依据。1. 激发光谱通过测量荧光(或磷光)体的发光通量(即强度)随激发光波长的变化而获得的光谱，称为激发光谱。激发光谱的具体测绘方法是，通过扫描激发单色器，使不同波长的入射光照射激发荧光(磷光)体，发出的荧光(磷光)通过固定波长的发射单色器而照射到检测器上，检测其荧光(磷光)强度，最后通过记录仪记录光强度对

22、激发光波长的关系曲线，即为激发光谱。通过激发光谱，选择最佳激发波长发射荧光(磷光)强度最大的激发光波长，常用ex表示。2. 发射光谱，也称荧光光谱或磷光光谱通过测量荧光(或磷光)体的发光通量(强度)随发射光波长的变化而获得的光谱，称为发射光谱。其测绘方法是，固定激发光的波长，扫描发射光的波长，记录发射光强度对发射光波长的关系曲线，即为发射光谱。通过发射光谱选择最佳的发射波长发射荧光(磷光)强度最大的发射波长，常用em表示。磷光发射波长比荧光来得长，图14.3为萘的激发光谱及荧光和磷光的发射光谱。 图14.3     萘的激发光谱、荧光和磷光光谱3. 荧光

23、激发光谱和发射光谱的特征 斯托克斯位移在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光发射波长总是大于激发波长，em>ex 。Stokes于1852年首次发现这种波长位移现象，故称Stokes位移。斯托克斯位移说明了在激发与发射之间存在着一定的能量损失。激发态分子由于振动弛豫及内部转移的无辐射跃迁而迅速衰变到S1电子激发态的最低振动能级，这是产生其位移的主要原因；其次，荧光发射时，激发态的分子跃迁到基态的各振动能级，此时，不同振动能级也发生振动弛豫至最低振动能级，也造成能量的损失；第三，溶剂效应和激发态分子可能发生的某些反应，也会加大斯托克斯位移。 荧光发射光谱的形状与激发波长无关由于荧光发射是激发态的

24、分子由第一激发单重态的最低振动能级跃迁回基态的各振动能级所产生的，所以不管激发光的能量多大，能把电子激发到哪种激发态，都将经过迅速的振动弛豫及内部转移跃迁至第一激发单重态的最低能级，然后发射荧光。因此除了少数特殊情况，如S1与S2的能级间隔比一般分子大(如)及可能受溶液性质影响的物质外，荧光光谱只有一个发射带，且发射光谱的形状与激发波长无关。 荧光激发光谱的形状与发射波长无关由于在稀溶液中，荧光发射的效率(称为量子产率)与激发光的波长无关，因此用不同发射波长绘制激发光谱时，激发光谱的形状不变，只是发射强度不同而已。 荧光激发发光谱与吸收光谱的形状相近似，荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系

25、0;物质的分子只有对光有吸收，才会被激发，所以，从理论上说，某化合物的荧光激发光谱的形状，应与它的吸收光谱的形状完全相同。然而实际并非如此，由于存在着测量仪器的因素或测量环境的某些影响，使得绝大多数情况下，“表观”激发光谱与吸收光谱两者的形状有所差别。只有在校正仪器因素后，两者才非常近似，而如果也校正了环境因素后，两面的形状才相同。如果把某种物质的荧光发射光谱和它的吸收光谱相比较低，便会发现两者之间存在着“镜像对称”关系。如图14.4分别表示苝的苯溶液和硫酸奎宁的稀硫酸溶液的吸收光谱和荧光发射光谱。为什么两种光谱会互为镜像关系呢？这不难由荧光发射光谱和吸收光谱的成因来解释。吸收光谱中的第一吸收

26、带(波长较长的吸收带)是由于基态分子吸收光能量被激发到第一电子激发态的各不同振动能级，所以，其形状取决于第一电子激发态中各振动能级的分布情况(即能量间隔情况)，而荧光光谱是激发态分子从第一电子激发单重态的最低振动能级跃回基态中的各不同振动能级所致，所以荧光光谱的形状取决于基态中各振动能级的分布情况。一般情况下，基态和第一电了激发单重态中振动能级的分布情况是相同的，所以荧光发射光谱与吸收光谱的形状是类似的。图14.5     镜像对称规则另一方面，吸收时由基态的最低振动能级跃迁到第一电子激发态的各振动能级，振动能级越高，所吸收的能量越大，即吸收峰的波长越短

27、；而相反，荧光发射是由第一电子激发单重态的最低振动能级跃迁回基态的各振动能级，振动能级越大，所释放的能量越小，即发射的荧光峰波长越长。另外，由于电子跃迁的速率非常之快，以致于跃迁过程中分子中原子核的相对位置没有明显发生变化，其结果是，假如吸收时由S0的V=0与第一激发态S1的V=2 之间的跃迁几率最大(即强度最大)，那么在荧光发射时，由S1的V=0跃回S0的V=2的几率也应该最大，如图14.5所示。基于上述原因，荧光发射光谱与吸收光谱之间显现镜像对称关系。七、有机化合物的荧光在已知大量的有机化合物当中，仅有一小部分会发射强的荧光，这与有机化合物的结构密切相关。能发射强荧光的有机化合物通常具有以

28、下的结构特征：1. 具有电子跃迁类型的结构实验表明，大多数能发荧光的化合物都是由或跃迁激发，然后经过振动弛豫等无辐射跃迁，再发生或跃迁而产生荧光。而其中吸收时跃迁的摩尔吸光系数比跃迁的大102103倍， 跃迁的寿命(107109)比跃迁的寿命(105107)短，因此荧光发射的速率常数Kf值较大，荧光发射的效率高。因此，跃迁发射荧光的强度大。此外，在跃迁过程中，通过系间跨跃从单重态跃迁至三重态的速率常数KISC也比较小，有利于荧光的发射。总之，跃迁的类型是产生荧光的最主要跃迁类型。2. 具有大的共轭键结构发生荧光(或磷光)的物质，其分子都含有共轭双键(键)的结构体系。共轭体系越大， 电子的离域性

29、越大，越容易被激发，荧光也就越容易发生，且荧光光谱向长波移动。大部分荧光物质都具有芳环或杂环，芳环越大，其荧光(或磷光)峰越向长波移动，且荧光强度往往也较强。例如苯和萘的荧光位于紫外区，蒽位于蓝区，丁省位于绿区，戊省位于红区,见表14.1。同一共轭环数的芳族化合物，线性环结构者的荧光波长比非线性者要长，如蒽和菲，其共轭环数相同，前者为线性环结构，后者为“角”形结构，前者em为400nm，后者em为350nm。3. 具在刚性平面结构实验发现，多数具有刚性平面结构的有机化合物分子都具有强烈的荧光，因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其他溶质分子之间的相互作用减少，即可减少能量外部转移的损

30、失，有利于荧光的发射。而且平面结构可以增大分子的吸光截面，增大摩尔吸光系数，增强荧光强度。酚酞与荧光黄(亦称荧光素)的结构十分相近(下图所示)，只是由于荧光黄分子中的氧桥使其具有刚性平面结构，因而在溶液中呈现强烈的荧光，在0.1mol·L-1的NaOH溶液中，荧光效率达0.92，而酚酞却没有荧光。又如芴与联二苯(下图所示)，由于芴中的亚甲基使分子的刚性平面增加，导致两者在荧光性质上的显著差别，前者荧光产率接近于1，后者仅为0.18。萘与维生素A都具有5个共轭键(下图所示)，而前者为平面结构，后者为非刚性结构，因而前者的荧光强度为后者的5倍。4. 取代基的影响取代基的性质(尤其是生色基

31、团)对荧光体的荧光特性和强度均有强烈的影响。芳烃及杂环化合物的荧光激发光谱、发射光谱及荧光效率常随取代基的不同而异，由于目前对于激发态分子的性质了解还很不够，尚不能真正从机制上揭开其影响的秘密。其影响规律多出自实验总结和推测。表14.2列出了部分取代基对苯的荧光特性的影响情况。取代基的影响主要有以下几个方面。 给电子取代基使荧光加强 属于这类基团的有NH2，NHR，NR2，OH，OR，CN等。由于这些基团上的n电子云几乎与芳环上的电子轨道平行，因而实际上它们共享了共轭电子，形成了p共轭，扩大共轭体系。因此，这类化合物的荧光波长变长，荧光强度增大(比较表14.2中的苯、苯胺、苯酚、苯基

32、氰)。考察这类取代基对荧光特性的影响时必需注意，这类基团中的n电子容易与极性溶剂相互作用，甚至形成氢键；另一方面，这类基团往往是酸基或碱基，在碱或酸介质中容易转化为其盐(共轭碱或共轭酸)，如酚在NaOH中，OH转化为O ，苯胺在酸中，NH2转化为NH3，它们的荧光均大为减弱。 吸电子基团使荧光减弱而磷光增强属于这类基团的有如羰基(COOH，CHO，)，硝基(NO2)及重氮基等。这类基团都会发生跃迁，属于禁阻跃迁，所以摩尔吸光系数小，荧光发射也弱，而 的系间跨跃较为强烈，同样使荧光减弱，相应磷光增强。例如二苯甲酮，其的系间跨跃产率接近1，它在非酸性介质中的磷光很强。硝基苯中NO2对荧光体荧光的抑

33、制作用尤为突出，硝基苯不发射荧光，其的产率为0.60。但令人费解的是硝基苯的磷光也很弱，普遍认为可能产生比磷光速率更快的非辐射的系间跨跃，或发生光化学反应。和给电子基团一样，吸电子基团也都存在n电子，所以对极性溶剂及酸，碱介质都较为敏感。 取代基位置的影响  取代基位置对芳烃荧光的影响通常为：邻位，对位取代者增强荧光，间位取代者抑制荧光(CN取代基例外)。取代基的空间阻碍对荧光也有明显的影响。如下面化合物萘环上的8位引入SO3基时，由于空间阻碍使NR2与萘之间的键扭转而减弱了平面构型，影响了p共轭，导致荧光的减弱。同样，1,2二苯乙烯的反式异构体是强荧光物质，而顺式异构体不发射荧光。

34、八、无机化合物的荧光无机化合物的荧光有无机盐类的荧光和金属螯合物的荧光两种： 某些无机盐类的荧光无机化合物本身能发荧光(或磷光)的不多，常见的主要有镧系元素()的化合物，U()化合物，类汞离子化合物Tl()、Sn()、Pb()、As()、Sb()、Bi()、Se()、Te()等，以及某些过渡金属离子，如Cr()等。这些化合物在低温(液氮)下都有较高的荧光效率和选择性，因此常用低温荧光法进行测定。 金属螯合物的荧光不少不发荧光的无机离子与具有吸光结构的有机试剂发生配合作用，生成会发荧光的螯合物，可以进行荧光测定。这种能发荧光的螯合物可能是螯合物中配位体的发光，也可能是螯合物中金属离子的发光。 螯

35、合物中配位体的发光。这一类螯合物中金属离子的外电子层具有与惰性气体相同的结构，为抗磁性的离子，它与含有芳基的有机配位体形成螯合物时多数会发射较强的荧光。这是因为原来的配位体虽有吸收光构型，但其最低激发单重态的S1是n型，及缺乏刚性平面结构，所以并不发荧光，而与金属离子配合后，配位体变为最低激发单重态的型，且由于螯合物的形成，而具有刚性平面结构，因此能发射荧光。如下列例子所示 螯合物中金属离子的荧光。这些金属离子的次外层中具有未充满电子的d轨道或f轨道，它们吸收光时，会发生或的吸收跃迁。也会发生或的发光跃迁，但跃迁几率很小，吸光及发光很弱。当与配位体螯合时，则首先是发生配位体的 吸收跃迁，而通常

36、金属离子的或能层在配位体激发后最低激发单重态S1能层的下方，因而可以发生能量的转移，由S1转移给或，然后发生 或跃迁，使跃迁几率增大，发光强度增大。九、荧光（或磷光）量子产率激发态分子的去激发包括两种过程，即无辐射跃迁过程和辐射跃迁过程，辐射跃迁可发射荧光(延迟荧光)或磷光。而有多少比例的激发分子发射出荧光(或磷光)呢。可以用荧光量子产率-有时也叫荧光效率或荧光产率(或磷光量子产率)表示。定义为：荧光物质吸光后所发射荧光的光量子数与所吸光的光量子数之比，即：许多吸光物质并不能发射荧光，这是因为激发态分子的去激发过程中，除发射荧光(磷光)外，还有无辐射跃迁过程与之竞争。所以，荧光量子产率与其他各

37、种过程的速率常数有关。表14.4列出分子吸光及去激发的过程及速率常数。因此，可以表示为：式中，Ki为无辐射跃迁各种过程的速率常数之和，即Ki KICKISCKQQ。从上式可以看出，凡是能使Kf值升高而使其它Ki值降低的因素，都可以提高量子产量，增强荧光。对于高荧光分子(如荧光素)来说，接近于1，说明该分子的Kf较大，Ki相对于Kf可忽略不计。一般荧光物质小于1，不发荧光的物质Kf为0，0。一般说来，Kf主要取决于化学结构(上节已叙述)，Ki则主要取决于化学环境的因素，同时也与化学结构有关。从各种速率常数还可以得到荧光寿命f: 磷光的量子产率与荧光量子产率相似。十、荧光强度与荧光物质浓度的关系荧

38、光强度If正比于吸收的光量(光强)Ia及荧光量子产率：If=Ia吸收的光量(光强)Ia应为入射光的光强I0与透射光的光强 It 之差，即： Ia I0It根据吸收定律(朗伯-比耳定律)： 所以：式中，为摩尔吸光系数，b为样品溶液的光程(即液池的厚度)，C为样品的摩尔浓度。而的展开式为：当浓度C很稀，吸收光量不超过总光量的2时，(约为0.02)，则展开式的高次项可忽略，即：所以： 当I0及b一定时：IfKC上式表明，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这是荧光分析法定量分析的依据。但是，应该注意的是，此式只适合于荧光物质的稀溶液。当C较大，时，线性关系将受到破坏。其原因是受激后的激发态分子与体系中的

39、其他分子所碰撞，使其以非辐射击跃迁的形式去激化，产生荧光猝灭，或者激发态分子所发射的荧光被没受激发的分子所吸收，而又因一般小于1，所以发生所谓的“自吸收”现象而使荧光减弱。为了减少碰撞去激发的机会，可以用降低温度，增大溶液粘度或把荧光(磷光)物质附着在固体支撑物测定的方法，以减少猝灭效应。特别要指出的是磷光发射，因其平均寿命较长，碰撞去激发的效应更大，所以常采用低温磷光或固体磷光方法。十一、影响荧光强度的环境因素影响荧光强度的因素除了荧光物质的本身结构及其浓度以外，环境也是一个很重要的因素，主要是溶剂、温度、介质酸度、氢键的形成及其它的因素。1. 溶剂的影响同一种荧光体在不同的溶剂中，其荧光光

40、谱和荧光强度都可能会有显著的差别，尤其是那些在芳环上含有极性取代基的荧光体，它们更容易受到溶剂的影响。溶剂的影响一般分为一般的溶剂效应和特殊的溶剂效应。 一般溶剂效应指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。这种影响是普遍存在的。一般情况下，折射率加大，将使荧光光谱的Stokes位移减少，而介电常数加大，将使Stokes位移加大，且荧光效率提高。 特殊溶剂效应指的是荧光体与溶剂分子的特殊化学作用，如氢键的形成和某些化合作用。特殊溶剂效应对荧光光谱及强度的影响往往大于一般溶剂效应。对于荧光发射的主要电子跃迁类型跃迁来说，电子激发态比基态具有更大的极性，所以随着溶剂极性的增大，对激发态比对基态产生更大的

41、稳定作用，因此降低了跃迁的能量，荧光光谱发生红移，而且荧光增强。表14.5为8-巯基喹啉在几种不同溶剂中荧光特性。但应该注意到一些相反的情况，如苯胺萘磺酸类化合物随溶剂极性的增大，光谱发生蓝移，且强度降低。如果溶剂分子与荧光物质形成氢键，将使荧光峰明显红移，荧光强度一般增大。如果溶剂分子和荧光物质形成化合物，或溶剂使荧光物质的电离状态或存在型体发生变化，则荧光峰位置和强度都会发生较大的变化。此外，在含有重原子的溶剂(如碘化乙酯、二碘烷、溴化正丙酯等)中，一般也使荧光体的荧光强度降低，而使磷光强度升高，这种现象称为“外重原子效应”。溶剂中重原子的高核电荷引起溶质分子的自旋与轨道之间强烈的耦合作用

42、，结果使 的系间跨跃、磷光发射及的系间跨跃等过程的几率增大。因此荧光削弱，而磷光增强。2. 温度的影响温度对于溶液的荧光强度有着显著的影响。通常，随着温度的增高，荧光物质溶液的荧光量子产率及荧光强度将降低，图14.7为不同温度下邻菲啰啉的荧光光谱。图14.7     不同温度下邻菲啰啉的荧光光谱（在邻二苯中）当溶液不存在猝灭剂时，荧光的量子产率与去激化的辐射跃迁过程及非辐射跃迁过程的相对速率有关。一般认为辐射过程速率不随温度变化，因此，荧光量子产率的变化反映了非辐射跃迁过程速率的变化。随着溶液温度的升高，介质粘度降低，分子运动速率也变大，从而使荧光分子与

43、溶剂分子或其它分子的碰撞几率增加，外部能量转移速率变大。因此，荧光量子产率降低。 溶液温度上升而使荧光强度降低的另一个主要原因是分子的内部能量转化作用。多原子分子的基态和激发态的位能曲线可能相交或相切于一点，如图14.8所示。图14.8     内部能量转化的位能曲线当激发态分子接受到额外热能而沿激发位能曲线AC移动至交点C时，有可能转换至基态的位能曲线NC，使激发能转化为基态的振动能，随后通过振动弛豫而丧失振动能量。3介质酸度的影响带有酸性基团或碱性基团的大多数芳香族化合物，其荧光特性都与溶液的酸度(pH)有关。这是因为在不同酸度介质条件下，荧光体的存

44、在型体不同，不同的型体(分子与其离子)在电子构型上有所不同，而且基态和激发态所表现出来的酸、碱性也有所差别。因此不同酸度下，荧光光谱和荧光强度都可能发生变化。所以在荧光分析中一般都要较严格地控制溶液的pH值。下列为两个实例：利用金属离子与有机试剂反应生成螯合物而进行荧光测定时，也受到溶液pH的影响。一方面pH会影响螯合物的生成和稳定性，另一方面还可能影响螯合物的组成，因而影响它们的荧光特性。例如，Ga3+与2，2-二羟基偶氮苯在pH3-4溶液中生成1：1的配合物，它能发射荧光；而在pH6-7溶液中则生成1：2的配合物，它不发射荧光。4. 形成氢键的影响荧光物质与溶剂分子或其他溶质分子所形成的分

45、子间氢键可能有两种情况：一种是在激发之前荧光体的基态所形成的氢键，这种情况一般使摩尔吸光系数增大，即吸收增强，因此荧光强度增大。同时也可能发生分子极性及共轭程度的变化，因此吸收光谱(荧光激发光谱)及荧光发射光谱都可能发生变化。另一种情况是激发之后荧光体的激发态所形成的氢键，所以吸收光谱(激发光谱)不受影响，而荧光发射光谱会发生变化。5. 其他方面影响表面活性剂的存在对荧光光谱及强度都会产生影响。荧光体在由表面活性剂形成胶束的微环境中，不仅可以减少非辐射去激化过程和猝灭过程的速率，提高荧光量子产率，而且由于表面活性剂参与组成配合物而增大分子的有效吸光截面积，导致摩尔吸光系数的增大。因此，在胶束溶

46、液中，荧光强度增强，测定的灵敏度提高。多元配合物的形成通常也可以增强荧光强度，提高荧光测定的灵敏度。十二、荧光的猝灭荧光的猝灭(熄灭)一词，从广义上说，指的是任何可使某给定荧光物质的荧光强度降低的作用，或者任何可使荧光强度不与荧光物质的浓度呈线性关系的作用。从狭义上说，指的是荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子之间的相互作用，导致荧光强度降低的现象。与荧光物质发生相互作用而使荧光强度降低的物质，称为猝灭剂。荧光猝灭的形式很多，机理也比较复杂。主要有如下几种类型：1. 碰撞猝灭碰撞猝灭是荧光猝灭的主要类型之一。它指的是处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子Q相碰撞，使释放热量给环境，以无辐射的形式

47、跃迁回基态，产生猝灭作用，这种猝灭也称动态猝灭。这一过程可以表示如下：根据荧光量子产率的定义，在无Q时的量子产率0及Q存在时的量子产率q 分别为:则无Q时的荧光强度(If)0及Q存在时的荧光强度(If)q之比为: 式中，K称为猝灭速率常数，可以推得，K与热力学温度T成正比，与溶液的粘度成反比。可见，碰撞猝灭效应随温度的升高而增强，而随粘度的增大而降低。2. 生成化合物的猝灭生成化合物的猝灭也称为静态猝灭，它指的是基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭，可用下式表示：从上式也容易推导出荧光强度与猝灭剂平衡浓度之间的关系：式中(If)0及(If)q分别为加入猝灭剂Q之前及之后

48、的荧光强度，CM为荧光物质的总浓度。上式与动态猝灭的关系式一样，只是常数K的意义不同。利用上面的关系式可以用于荧光猝灭法的定量分析。3. 能量转移猝灭当猝灭剂吸收光谱与荧光体的荧光光谱有重叠时，处于激发单重态的荧光体激发分子的能量就可能转移到猝灭剂分子上，或者猝灭剂吸收了荧光体发射的荧光，使荧光猝灭，而猝灭剂被激发，这种猝灭俗称“内滤作用”。可用下式表示：4. 氧的猝灭O2可以说是荧光和磷光的最普遍存在的猝灭剂。对于溶液磷光来说，氧的猝灭作用是十分有效的，通常观察不到溶液的室温磷光现象。而对于溶液荧光来说，不同的荧光物质或同一荧光物质在不同的溶剂中，对氧的猝灭作用的敏感性有所不同。氧对溶液荧光

49、产生猝灭作用的原因比较复杂，还没有一个完整的确定说法，可能包含着多种机理。有的认为可能是由于三重态的氧分子和激发单重态的荧光分子相互作用形成激发单重态的氧分子和激发三重态的荧光分子所引起的，如下式表示：也有的认为氧和其它顺磁性的物质一样，它们之所以会使荧光猝灭，是由于它们能够促进激发单重态的荧光分子的系间跨跃()以及提高荧光物质基态分子的系间吸收跃迁()的几率；还有的认为荧光猝灭是由于荧光物质受到氧化的缘故。5. 转入三重态的猝灭在“重原子效应”段落已经叙述，溴化物和碘化物都能产生“重原子效应”，促使荧光分子的激发单重态转入激发三重态，导致荧光的猝灭。上面也已提及，氧的猝灭作用也可能是O2促使

50、荧光体分子转入激发三重态所致。6. 荧光物质的自猝灭当荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低，荧光强度与浓度不成线性关系，称为荧光物质的自猝灭。自猝灭可能有如下几个原因： 荧光物质分子之间的碰撞能量损失，这实际上是能量的外部转移形式。 荧光物质的自吸收，当荧光物质的吸收光谱与荧光发射光谱重叠时，会发生自吸收现象，处于S1激发态的分子发射的荧光被处于基态的分子所吸收，使荧光强度降低。 荧光物质分子的缔合。某些荧光体分子处于基态时会形成二聚体或多聚体，或者激发态分子1M*与基态分子M形成激发态二聚体1(M*M)。这些聚合物与荧光单体一般都会具有不同的荧光特性，有的使荧光强度降低甚至不发射荧光，有的

51、使光谱发生变化。此外，还有电荷转移猝灭，光化学反应猝灭等，不一一叙述。十三、荧光分析仪荧光分析仪器与紫外-可见分光光度计的基本组成部件相同，即有光源、单色器、样品池、检测器和记录显示装置五个部分。荧光仪器的单色器有两个，分别用于选择激发波长和荧光发射波长。除了基本些部件的性能不同外，荧光仪器与紫外-可见分光光度计的最大不同是，荧光的测量通常在与激发光垂直的方向上进行，以消除透射光和杂散光对荧光测量的影响。其结构示意图如图14.9所示。荧光分析仪的各主要部件简要分述如下：1. 激发光源激发光源应具有足够的强度、适用波长范围宽、稳定等特点。常用的光源有高压汞灯和氙弧灯。 高压汞灯高压汞灯是以汞蒸气

52、放电发光的光源，主要有365、405、436nm 的三条谱线，尤以365nm谱线最强，一般滤光片式的荧光计多采用它为激发光源。 氙弧灯氙弧灯通常就叫氙灯，是目前荧光分光分度计中应用最广泛的一种光源。它是一种短弧气体放电灯，外套为石英，内充氙气，室温时其压力为506625Pa，工作时压力为2026500Pa，具有光强度大，在200800nm 范围内是连续光源的特点。氙灯的灯内气压高，启动时的电压高（2040KV），因此使用时一定要注意安全。此外，高功率的可调谐染料激光器是一种新型的荧光激发光源。这种光源不需单色器和滤光片，具有单色性好，强度大，脉冲激光时间短而减少光敏物质的分解等优点。但是仪器设

53、备较复杂，所以应用还不广泛。2. 单色器荧光分析仪中应用最多的单色器为光栅单色器，称为荧光分光光度计。光栅有两块，第一块为激发单色器，用于选择激发光的波长，第二块为发射单色器，用于选择荧光发射波长，一般是后者的光栅闪耀波长比前者来得长一些。在比较低档次的荧光计中，采用滤光片作为单色器，多使用干涉滤光片以获得纯度较好的“单色光”。第一滤光片用以分离出所需用的激发光，第二滤光片用以滤去杂散光、瑞利光、拉曼光和杂质所发射的荧光。3. 样品池荧光分析的样品池通常用石英材料做成，它与吸光分析法的液池不同在于，荧光样品池的四面均为磨光透明面，同时一般仅有一种厚度为1cm的液池。4. 检测器简易型的荧光计可

54、用目视检测，或用硒光电池，光电管检测。现在的荧光计多采用光电倍增管进行检测。检测器的方向应与激发光的方向成直角，以消除样品池中透射光和杂散光的干扰。 在现代的高级仪器中，光导摄象管用来作为光学多道分析器（简称OMA）的检测器。它具有检测效率高、动态范围宽、线性响应好、坚固耐用和寿命长等优点。它的检测灵敏度虽不如光电倍增管，但却能同时接受荧光体的整个发射光谱。5. 记录，显示装置荧光仪的读出装置有数字电压表或记录仪。现代仪器都配上计算机，进行自动控制和显示荧光光谱及各种参数。十四、荧光仪器的校正及灵敏度1. 仪器的校正人们总希望仪器能记录荧光物质真实的荧光激发光谱和发射光谱，这种理想化的仪器应该

55、是激发光源、单色器及检测器等各部分在所需要的整个波段中，性能都一样，如图14.10所示。但是这种理想化的光学部件实际上并不存在，因此，对于一些较特殊的测定（如荧光量子产率的测定计算，动力学的某些研究等），需对实际测定的“表观光谱”进行校正，以获得真实的光谱。图14.10     理想化仪器的光谱特性对荧光激发光谱和发射光谱的校正比较复杂，如有需要可参考有关专著。在现代仪器上，不少已在荧光分光光度计上装配有光谱校正装置。此外，杂质光对荧光测量也有明显的影响，必须注意加以清除，在不少仪器中也还有杂质光的校正装置。2. 荧光仪器的灵敏度荧光分析法的灵敏度包含有

56、两个部分：一是荧光体的本身因素，即荧光体的吸光系数及荧光量子产率；二是荧光仪器因素，它受到光源强度、稳定性、单色器的杂散光水平、光电倍增管的特性、高压电源稳定性及放大器的特性诸因素的影响。与紫外可见分光光度法比较，荧光分析法的灵敏度要高出24个数量级，这主要取决于仪器的因素。其一，荧光强度正比于入射光的强度，所以增大光源的强度可以提高灵敏度，降低检测限；其二，荧光的测量是在激发光的垂直方向检测的，即在暗背景中检测，所以只要较好地消除杂散光，采用较灵敏的检测器，很微弱的荧光都可以检测，所以检测限较低。而吸光分析法是在亮背景下检测透射光与入射光强度的比值，所以当强度较小时，透射光与入射光强度相差很

57、小，因此不能准确的检测，所以检测限较高。用检测限来表示荧光法的灵敏度，在实际工作中是比较直观和方便的。荧光分析法的检测限可以有两种表示方法：一是以喹宁表示，在0.05mol·L1硫酸中，喹宁的荧光峰为450nm，当喹宁溶液很稀（如0.05g·L1）时，溶剂的拉曼峰所造成的对喹宁荧光信号的噪声已相当显著。因此人们常以此时喹宁信号与仪器噪声之比的喹宁浓度定为该仪器的检测灵敏度。多数仪器的检测灵敏度为0.05g·L1喹宁，有些灵敏度高的仪器可达0.005g·L1喹宁；二是以水的拉曼光信噪比表示，当水分子被激发时，水分子蒙受暂时的畸变，在极短的时间内（10121

58、015s），会向各个方向发射出与激发光波长相等的瑞利光和波长略长的拉曼光。通过测量拉曼光的信噪比可以衡量仪器的检测灵敏度。由于纯的水易得，用同一波长的光激发水分子所产生的拉曼光波长一样，便于检测，所以用拉曼光信噪比表示仪器的灵敏度已为较多的产家所采用。十五、磷光分析仪与荧光分析仪的差别磷光分析仪器与荧光分析仪器同样由五个基本部件组成，但需要有一些特殊的配件，在比较好的荧光分析仪器上都配有磷光分析的配件，因此两种方法可以用同一仪器。磷光分析仪器与荧光分析仪器的主要区别有两点。1. 样品池需配有冷却装置对于溶液磷光的测定，常采用低温磷光分析法，即试样溶液需要低温冷冻。通常把试液装入内径约1-3mm的石英细管（液池）中，然后将液池插入盛有液氮的石英杜瓦瓶内，如图14.11所示。图14.11     低温磷光分析的样品池