钆喷酸葡胺脂质体的制备与研究

1、    钆喷酸葡胺脂质体的制备与研究             作者：张娜，赵振义，王雨青时间：2007-11-22 11:47:00                     【摘要】 本文采用改良逆相蒸发法-膜挤压法相结合将水溶性顺磁性造影

2、剂钆喷酸葡胺制成小单室脂质体（SUV），方法简单、重现性好，显示了可进一步工业化的良好前景。激光散射法测得脂质平均粒径为195nm。4避光放置6个月，各项理化指标基本无变化。对制剂的急性毒性研究结果表明，钆喷酸葡胺及钆喷酸葡胺脂质体的ivLD50值分别为8.00mmol/kg和9.56mmol/kg，这提示脂质体可降低药物的毒性。而影像学结果进一步证明了钆喷酸葡胺脂质体具有靶向性。     【关键词】 钆喷酸葡胺；脂质体；制备研究     Research and preparation of liposomal Gd-DT

3、PA    【Abstract】 We used a modified reverse-phase rotary evaporate-extrution method to obtain liposomes containing Gd-DTPA. We had developed a modified one of this technique. The method was simple and good reproduce. It was ideally suitable for scaling-up for production purpose. The m

4、ean diameter of liposomes was 195nm, which was determined by laser scattering，this liposomal formulation had no evident effects under 4. The iv LD50 of free and liposomal Gd-DTPA was 8.00mmol/kg and 9.56 mmol/kg, respectively. This suggested that Gd-DTPA liposomes had a proven effect in reducing tox

5、icity. Result of imaging confirmed liposomal Gd-DTPA possesed target for liver and spleen.    【Key words】 Gd-diethylenetriamine pentaacetic acid;liposomal;preparation and research    1982年由德国先灵（Schering AG）公司的威曼等人制备成功的钆喷酸葡胺（NMG）2-Gd-DTPA是研究和应用最多的造影剂，并在1984年报告了首次应用于人体的结果

6、。由于它能在正常和病变组织间增加额外对比度，使MRI诊断的敏感性和特异性均得以提高，故很快被人们所接受。钆喷酸葡胺是细胞外离子型造影剂1，它主要用于颅脑、脊柱及全身的磁共振成像，特别是对脑的造影是安全有效的26。由于它主要通过肾脏快速代谢1,7，能与细胞外空间快速平衡及快速的肾清除，不适用于肝、脾肿瘤的成像810。在分布上无特殊的靶器官，或者说它是一种无专一性分布的造影剂。为了提高肝、脾肿瘤的成像效果，使钆喷酸葡胺具有器官靶向性，可用脂质体作为药物的载体来达到此目的。在这方面的研究国外已有报道1114，实验证明了包封于脂质体中的钆喷酸葡胺具有肝、脾器官靶向性。本实验以豆磷脂和胆固醇为成膜材料，

7、制备了钆喷酸葡胺脂质体，并对其体内外稳定性进行了研究，以期为钆喷酸葡胺脂质体的进一步开发以及将来应用于临床提供实验依据。    1 仪器与材料    1.1 仪器 高速离心机（沈阳理化仪器厂），Zetasizer 3000（英国Malvern仪器公司），ZM-420透射电镜（Philips），NDJ79旋转式粘度计（同济大学机电厂），DL302-1电热恒温箱（上海天淞五金厂）。    1.2 材料 Gd2O3（北京有色金属研究院），DTPA（北京福星化工厂），甲葡胺（北京北陆医药有限公司），精制大豆磷脂（

8、上海油脂一厂），胆固醇（上海生化试剂厂），钆喷酸葡胺注射液（先灵广州药业有限公司），生理盐水（双鹤药业），其他试剂均为分析纯。    2 方法与结果    2.1 钆喷酸葡胺脂质体的制备 参考文献初步拟定以下基础处方15：300mg卵磷脂，75mg胆固醇及0.1%量的VE，制成10ml。    2.2 处方优化 根据单因素考察结果，首先确定缓冲液的离子强度，处方成分为磷脂、胆固醇、十八胺和药物，把磷脂（PC）用量、胆固醇（Chol）用量、十八胺（SA）用量及成膜时温度（T）作为4个考察因素。选择U10（1

9、04）均匀表可得10组处方，利用人工神经网络系统进行处方优化，主要考察指标为脂质体的外观、KE值及沉降体积比F，最终确定最佳处方为：磷脂250mg，胆固醇50mg，十八胺20mg，药物浓度0.5M，制备成脂质体10ml。    2.3 含量及包封率测定    A=0.0204C+0.008计算总药量。    QW=W包 W总=W总-W游 W总（2-1）    透析法：此法是最简单的也是最常用的除去未包裹药物的方法，它不需要复杂的技术，也无须昂贵的仪器，且能够扩大生产。本实验对

10、此方法进行考察，结合紫外法测定了钆喷酸葡胺脂质体的包封率。测得包封率平均为25.6%。    2.4 粒度分布 将脂质体用水稀释后在激光粒度分析仪上进行测定。结果表明，脂质体平均粒径为195nm。    2.5 脂质体稳定性的研究    综上所述，钆喷酸葡胺脂质体在4贮存6个月后，制剂的物理和化学稳定性良好，其外观、含量均变化不大，包封率下降也很低，仅为2%左右，粒径略有增大；而其在25贮存6个月后，制剂发生了一些物理变化，微粒有沉降聚集的现象发生，包封率下降为8%左右，且粒径明显增大。所以脂质体应在低温

11、（4）下避光、密封贮存。    2.6 急性毒性实验    3 影像学研究    3.1 菌种 H22肝癌瘤株由北京肿瘤防治研究所提供，每周腹腔注射1次传代。    3.3 磁共振成像 将接种上肝癌的小鼠分成两组：第一组，尾静脉注射市售的钆喷酸葡胺注射液；第二组，尾静脉注射钆喷酸葡胺脂质体。将注射药物后的小鼠进行磁共振扫描成像，观察肿瘤部位与正常组织间的区别，同时对两组成像效果进行比较，图像Fig. 1和Fig. 2如下（略）。 由图像可以看出，注射钆喷酸葡胺脂质体（b）小鼠

12、的肝肿瘤部位明显比其他正常组织发亮；而注射液组（a）肝肿瘤部位与正常组织的对比度不明显。因此，钆喷酸葡胺脂质体组与其注射液组相比更适合肝肿瘤的造影，它明显增强了肝肿瘤部位与正常组织间的对比度，影像学研究也表明了钆喷酸葡胺脂质体可作为肝靶向造影剂。    4 讨论    （1）本文曾采用煮沸及流通蒸气法对脂质体进行灭菌，但结果发现，有少量的磷脂聚集现象，并且包封率降低明显。对于脂质体这种含有不耐热和易氧化组分的微分散系统来说，高温灭菌对其破坏性较大，而且也有文献报道水溶性药物的脂质体不宜进行热灭菌16。所以本文在制备脂质体的过程中采用无

13、菌操作与膜过滤灭菌方法相结合。    （2）本文进行脂质体包封率测定时，曾采用过柱分离法和鱼精蛋白凝聚法。柱分离时由于钆的紫外特征峰的吸光度小，所以上柱稀释后，在线检测无法确定脂质体和游离药物是否分离完全；而鱼精蛋白凝聚时，发现仍有少量脂质体在水溶液中，这给测定带来很大的误差。由于钆喷酸葡胺极易溶于水，并且分子量也较小，对于透析法测定包封率是非常有利的，游离药物和脂质体可以完全分离开，所以本文采用了透析法测定脂质体的包封率。    （3）影像学研究中，本文采用的模型是异位移植，主要看肿瘤与肝脏在给药后的对比度。肿瘤移植的位置在图片的左

14、上角，注射液组（a）肝肿瘤部位（变亮）与肝组织（变亮）的对比度不明显，而注射钆喷酸葡胺脂质体（b）小鼠的肝肿瘤部位（变亮）与肝组织（基本无变化）的对比度明显，所以表明了钆喷酸葡胺脂质体可作为肝靶向造影剂。    【参考文献】    1 Brasch RC, Weinmann HJ, Wesbey GE. Contrast enhanced NMR imaging: animal studies using gadolinium-DTPA. AJR， 1984,142:625-630.    2 Felix

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