野生稻高产基因及其分子标记辅助育种研究

1、野生稻高产基因及其分子标记辅助育种研究邓启云1, 袁隆平1, 梁凤山2, 李继明1, 李新奇1, 王乐光2, 王 斌2( 1 国家杂交水稻工程技术研究中心，湖南长沙 410125；2 中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100101）摘要：传统遗传育种方法在挖掘和利用水稻栽培品种的遗传资源方面日趋饱和，进一步提高杂交水稻产量潜力必须考虑利用水稻野生近缘种的有利基因库。随着分子生物学技术的发展，分子标记辅助选择在定向导入远缘有利基因方面的研究日益成为活跃的研究领域。介绍了马来西亚普通野生稻的2个高产QTLs的发现，及其分子标记辅助育种的初步进展，并展望了这一领域的研究前景。关键词：野生稻高

2、产基因（QTL）；杂交水稻；分子标记辅助选择（MAS）中图分类号: 文献标识码: A.文章编号：Studies on Yield-enhancing Genes from Wild Rice and Its Marker-assisted Selection in Hybrid RiceDENG Qi-yun1, YUAN Long-ping1, LIANG Feng-shan2, LI Ji-ming1, LI Xin-qi1, WANG Yue-guang2, WANG Bin2( 1 China National Hybrid Rice Research and Development

3、Center (CNHRRDC), Changsha, Hunan 410125, Peoples Republic of China; 2 Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, Peoples Republic of China )Abstract: Facts have proved that genetic improvements are the most practicable way to increase rice producti

4、vity. But it is now quite limited to further raise the rice ceiling through traditional breeding methods based on the exploitation of genetic diversities within Oryza sativa. As the biotechnology fast developing recently, it becomes more and more important research field that breeders try to introdu

5、ce distantly related favorable genes into rice cultivars from wild relatives of rice. It is described here that the discovery of the two yield-enhancing QTLs from wild rice and preliminary studies on marker assisted selection (MAS) in hybrid rice breeding program. And the prospects in the realm of M

6、AS breeding were also discussed in the paper.Keywords: Yield-enhancing genes (QTLs) from wild rice; Hybrid rice; Marker-assisted selection (MAS)我国现有人口超过13亿，人均耕地面积不足867 m2, 预计本世纪30年代，我国人口将增加到16亿，人均耕地将减少到667 m2左右，粮食自给仍然是摆在我们面前的紧迫问题。从全球范围看，由于人口增长以及环境恶化和城市化发展所带来的耕地面积减少的趋势在相当长一段时间内还无法逆转，因此继续提高主要粮食作物单位面积产

7、量始终是各国政府和科学家关注的热点课题。水稻是最重要的粮食作物之一，实践证明，通过遗传改良来提高水稻单位面积产量是最行之有效的途径。1 水稻产量性状遗传改良的现状和挑战近三十年来我国常规水稻育种在发掘产量潜力方面基本处于徘徊状态，目前大面积推广的常规早稻新品种，其产量潜力基本和60年代选育的广陆矮4号相同。三系法杂交水稻的培育成功带来了一次水稻单产的飞跃，为解决我国粮食问题做出了巨大贡献。但近年来，由于受现有亲本遗传基础的限制，单产也出现了徘徊局面。在超级杂交水稻理论提出后，在充分利用水稻形态改良成就和亚种间杂种优势相结合的基础上，水稻产量又获得了显著提高。但是，由于水稻栽培种遗传资源的利用已

8、日趋饱和，并且许多改良品种具有相同或相似的遗传来源，容易造成遗传上的单一性，因此，在现有高产或超高产的前提下，欲进一步提高水稻产量潜力，必须寻求新途径，创制和利用具有丰富变异的新材料，这将是未来水稻产量潜力获得进一步突破的方向。进一步扩大亲本间的遗传差异，可以考虑从远缘种群中引入高产基因资源。栽培水稻有20多个野生近缘种，包含有极其丰富的遗传变异。为了拓宽栽培品种的遗传多样性，许多育种家都试图发掘这一重要的遗传资源宝库，并为此做出了不懈的努力，在质量性状方面已经取得了显著成效。如60年代发掘和利用来源于O. nivana的水稻草丛矮缩病持久抗性12；70年代，我国科学家又从O. rufipog

9、on中找到雄性不育细胞质基因，实现了杂交水稻的三系配套34；近年来人们又在长药野生稻中发现了高抗白叶枯病基因Xa-21，并将其转移到栽培稻中。但产量属于数量性状，由多基因控制，直接利用野生资源中的某一特定基因来改良水稻产量等数量性状，目前尚无先例。究其原因主要存在两大障碍：一是野生稻中存在大量对产量不利的性状干扰，使高产基因型的鉴定十分困难；二是连锁累赘，即目的基因与不利基因的紧密连锁是常规的远缘杂交育种中难以克服的难题。因此，要发掘和利用野生稻有利基因以用于改良栽培水稻产量潜力，必须开拓相应有效的新技术。2 分子标记的发展与应用近20 a年来迅速发展的基于DNA的分子生物学技术，如分子标记和

10、作图技术，不仅使鉴定数量性状基因位点成为可能，同时给育种提供了崭新的途径，这就是所谓的“分子标记辅助选择”（marker-assisted selection，MAS）。分子标记基于DNA分子变异，与形态学标记和同工酶标记相比，具有下列优点：(1) 基因组DNA的变异十分丰富，因此分子标记的数量几乎是无限的；(2) 多数分子标记(如RFLP，SCAR，SSR)都是共显性标记，对选择隐性基因控制的农艺性状十分有利；(3) 不同发育阶段、不同组织的DNA均可用于标记分析，使对作物基因型的早期选择成为可能；(4) 分子标记直接揭示来自DNA的变异，使育种家有可能依据植株基因型而不只是表现型来选择优良

11、性状。随着分子标记技术的发展，分子标记辅助选择和聚合育种技术亦得到迅速发展，大大提高了育种效率，加速了育种进程。Sheng Chen等通过分子标记辅助选择方法对杂交水稻恢复系明恢63进行改良，将Xa-21基因转移到明恢63，获得了抗白叶枯病的明恢63，从而达到对杂交水稻汕优63进行遗传改良的目的5。黄宁等利用分子标记辅助选择将白叶枯病抗性基因Xa-4, Xa-5, Xa-13 和Xa-21 聚合到同一水稻品种中，大大提高了其对白叶枯病的抗性6。在番茄的果重和可溶性固相物含量的改良方面，应用RFLP图谱技术定向转移微效数量性状基因已经获得成功。在已构建的RFLP图谱中定位了6个控制果重的QTL，

12、每一位点的作用幅度为3.56.0 g。还定位了4个控制可溶性固相物含量的QTL，每个位点的作用幅度为0.83%1.89%7。采用分子标记辅助选择技术，已成功地将这些有用的QTLs转移到商用番茄杂交种的染色体中，使产量增加20%以上。3 野生稻高产基因的发掘为从野生稻中发掘和利用有利基因以进一步提高杂交水稻产量潜力，自1992年以来，国家杂交水稻工程技术研究中心与美国康奈尔大学合作，着手从分子水平进行研究，从马来西亚普通野生稻（O. rufipogon）中发掘高产基因资源。用普通野生稻与栽培稻V20A不育系杂交，再用V20B连续回交两代，从BC2的3000株中选300株与测64-7测交配制成30

13、0个组合，每个组合含1.5%11.5%不等(平均为4.5%)的野生稻遗传信息。考种结果表明，大多数组合中含有的野生稻等位基因对产量没有增产效果或相对于栽培种中的等位基因是有害的影响。但来自野生稻1号染色体上RM5标记位点处以及2号染色体上RG256附近的2个QTLs却能明显地使产量增加，分别具有18%和17%的增产效应。同时，这些组合在千粒重、株高和生育期上与对照没有明显区别。1995年从300个BC2测交群体（V20A/马来西亚普通野生稻/V20B/V20B×测64-7）中发现有7个品系比对照（威优64）增产30%以上。经进一步分析，发现分别位于1号和2号染色体上的两个正向QTL位

14、点（即yld1.1和yld2.1），每一个具有在现有三系杂交稻基础上增产约18%的效应89。这一发现后来从其他一些野生稻产量QTL分析群体得到进一步证实，如国际热带农业研究中心（CIAT）的巴西粳稻群体10等，其高产基因也定位在第1染色体上与yld1.1相近的位置。2002年，我国学者李德军等以江西东乡普通野生稻为供体亲本, 在桂朝2号的遗传背景下，在第2和11号染色体上也发现了来自东乡野生稻的2个高产QTL，分别能使桂朝2号单株产量增加25.9%和23.2%11。由此可见，普通野生稻（O. rufipogon）是一个重要的有利基因库，其中存在高产QTLs的事实已毋庸置疑，而且借助于分子标记等

15、技术最终可能通过育种程序将这些QTLs集中起来加以利用，以提高水稻产量潜力。4 分子标记辅助育种策略应用分子标记辅助选择利用远缘有利基因的策略主要有回交转移、杂交转移、轮回选择和基因累加等方法，其中应用较多的是回交转移和杂交转移的方法。4.1 回交转移在利用分子标记辅助选择进行外源基因的转移时，必须保证目标基因位于足够大的染色体片断之内，同时又不能使这个片断太大，因为片断太大会使与目标基因连锁的非期望基因或不利基因也转移到受体亲本中，即带来连锁累赘(linkage drag)。以普通野生稻为高产基因供体，以生产上大面积应用的优良恢复系为高产基因受体和轮回亲本，进行杂交和连续回交，使分子育种建立

16、在一个产量水平较高的平台上，有利于充分发挥高产基因的增产效果。通过回交并对每个回交世代进行分子标记辅助选择，逐步建立起野生稻高产基因近等基因系，对中选的优良恢复系材料进行测交鉴定，最后根据大量测交F1的产量表现再决选恢复系株系。配制的杂交组合还同时进行生产试验和大面积示范以确认其实际增产效果。采用这种分子标记分析与田间选择、杂种鉴定相结合的方法，可以避免由于交换造成的含野生稻高产基因的DNA片段丢失。传统的回交转移方法最大的缺陷是多代回交后还存在着大量的来自供体亲本的非期望基因。利用分子标记辅助选择可直接选择在目的基因附近发生重组的个体，从而可望在很大程度上解决连锁累赘的问题，同时可以减少回交

17、代数1213。理论上，可能在回交一代就有一些个体的一些染色体是纯合的而目标基因是杂合的，选择它们进行回交将大大缩短育种进程，但这需要以前景选择（foreground selection）和背景选择（background selection）为前提1416。比较好的办法就是多进行两轮回交选择，即大大降低分子鉴定的费用。在西红柿上利用分子标记辅助回交育种方面的工作十分出色, 野生种的不少有益基因成功地转移到了栽培品种中1720。4.2 杂交转移杂交育种是杂交水稻亲本选育中一种普遍使用的育种方法。就前述野生稻高产基因yld1.1和yld2.1而言，由于它们是两个控制产量性状的主效QTL，每个QTL对

18、产量的贡献值都非常显著，因此也适合采用分子标记辅助的杂交育种策略将高产基因进行亲本间转移。近年来，以初步育成的携带野生稻高产基因的强优恢复系Q611为供体亲本与生产上大面积应用的优质或多抗的优良恢复系直接进行杂交，在F2或回交F2进行分子标记辅助选择，并将筛选的优良单株与不育系进行测交鉴定，比直接从普通野生稻中导入高产基因更容易稳定，中选的优良单株几率大大提高。玉米分子标记辅助育种研究证实，在杂交育种的早期世代就可以开展分子标记辅助选择21。但仅仅根据分子标记进行选择并不太有效，分子标记分析必须与田间选择相结合方可明显提高效率。5 野生稻高产基因分子育种效果由于野生稻高产基因yld1.1和yl

19、d2.1都是具有显著增产效应的主效QTL，因此借助分子标记辅助选择将其转入优良恢复系中，培育具有超高产潜力的杂交水稻新组合，从技术上讲是完全可行的。近年来，我们借助SSR等标记技术着手将两个高产QTL先后转移到优良恢复系测64-7、9311、明恢63等遗传背景中，并逐步建立近等基因系，已经培育了一批强优恢复系材料，对部分材料进行了测交鉴定，其杂种F1表现出强大的杂种优势，有望培育出超高产杂交稻新组合。以优良恢复系测64-7为受体的分子标记辅助育种为例，先以受体亲本与野生稻高产基因供体材料（来源于野生稻V20B回交系与测64-7的测交后代，即V20A/rufipogon/V20B/V20B /C

20、e64）杂交、回交，在每个回交世代分单株提取基因组DNA，然后以与紧密连锁的SSR标记进行扩增、分析，筛选在这两个位点含有野生稻扩增带的杂合基因型单株，再以受体亲本为轮回亲本连续回交至BC3F1。自交多代后，主要根据农艺性状进行田间选择，筛选优良单株与V20A、金23A等三系不育系测交，根据大量测交F1的产量表现再决选恢复系株系，并进一步通过分子标记验证野生稻高产基因的存在与否。5.1 田间选择和杂种优势表现在以测64-7为受体的BC3F1中筛选了7个优良单株，种植成7个株系，每个株系200株以上，并从中筛选优良单株自交。以后每个世代根据综合农艺性状筛选优良单株自交。2000年从BC3F5中筛

21、选到2个性状非常优良的株系Q608和Q611，测交鉴定表明，2个株系均具有强大的杂种优势。但进一步测交、制种试验显示，Q608本身容易受低温影响，结实率很不稳定，予以淘汰。而另一个株系Q611则结实稳定，花粉量足，与具有长江流域早籼稻遗传背景的不育系测交表现出强大的杂种优势，是配制三系超级杂交稻的强优恢复系。2001年小区品比试验，金23A/Q611比对照组合威优77增产30%以上。2002年在进一步筛选、稳定的基础上，继续测配组合进行品比和生产试验，在大田栽培条件下，金23A/Q611同样表现出强大的杂种优势，作双季晚稻栽培单产可获10.5 t/hm2以上，作一季晚稻栽培产量可达12.0 t

22、/hm2，具有超高产的产量潜力。2003年作双季晚稻栽培的“百亩示范片”单位面积产量比对照增加20%以上，大面积平均单产达9.75 t/hm2以上，高产丘块可达10.5 t/ham2以上（表1）。表1 金优611百亩示范栽培产量结构（2003）Table 1. Yield components of hybrid J611 on demonstration field (2003)示范户主Field owner面积area(m2)播种期/月-日Sowing date/M-D有效穗 /穗·m-2Productive panicles.m-2每穗总粒数Spikelets per pani

23、cle结实率Seed setting rate/%千粒重1000-grain weight/g理论产量Yield estimated/t·hm-2实际产量Actual yield/t·hm-2熊国安Xiong GA133306-16273.3195.684.826.011.810.5蒋德龙Jiang DL80006-19257.7200.283.225.811.110.0蒋雪阶Jiang XJ100006-20249.6199.885.226.311.29.4熊国辉Xiong GH133306-20257.4186.084.926.010.69.8蒋德虎Jiang DF10

24、0006-20255.3207.981.225.911.29.9威优46V/46(CK)73306-18268.8113.189.931.18.57.55.2 分子标记分析和验证经多态性分析，筛选在供体与受体亲本间具有多态性，同时与yld1.1紧密连锁的RM9和RM306，以及与yld2.1紧密连锁的RM166和RM208等4个SSR标记，对Q611不同株系进行分子标记分析。RM9和RM306位于第1染色体，它们与yld1.1分别相距2.5 cM和3.2 cM；RM166和RM208位于第2染色体，与yld2.1分别相距3.1 cM、6.5 cM。分析结果显示：选出的Q611不同株系在上述4个

25、标记位点都具有来自普通野生稻的扩增带型。在BC3F7有47.2%的单株在第2染色体的RM166位点显示野生稻扩增带型，筛选到75株在该位点纯合的单株。继续以另外3个分子标记扩增，筛选到15个在所有4个标记位点均具有野生稻扩增带型(图1, 图2)，并且农艺性状稳定的单株。经测交鉴定和进一步自交稳定筛选，最终培育成强优恢复系Q611，用于大面积制种和杂种生产示范。500bp250bpM 1 2 3 4.16图1 对Q611 BC3F7以RM166为引物扩增的部分结果M：DNA 分子量标记; 第1列：野生稻; 第2列：V20B; 第3列：测64-7; 第416列：Q611株系的不同单株。箭头指示野生

26、稻特异带。Fig. 1 Partial results screened by marker RM166 in Q611 BC3F7. M, DNA size marker; lane 1,rufpogon; lane 2, V20B; lane 3, Ce64; lane 416, individuals of Q611 family. Arrows indicate the specific bands of O. rufipogon250bp100bpM 1 2 3 4.16图2 对Q611 BC3F7以RM9为引物扩增的部分结果M：DNA 分子量标记; 第1列：野生稻; 第2列：V20

27、B; 第3列：测64-7; 第416列：Q611株系的不同单株。箭头指示野生稻特异带。Fig. 2 Partial results screened by marker RM9 in Q611 BC3F7 .M, DNA size marker; lane 1, rufpogon; lane 2, V20B; lane 3, Ce64; lane 416, individuals of Q611 family. Arrows indicate the specific bands of O. rufipogon6 结语形态改良与杂种优势相结合是进一步实施水稻产量性状遗传改良的一条最有效的技术路

28、线22。它包含两层含义：（1）通过育种途径进一步塑造水稻理想株叶形态，提高群体光能利用率；（2）进一步扩大杂种双亲遗传差异，提升水稻杂种优势利用水平。在现阶段除继续深入研究籼、粳亚种间杂种优势利用外，借助现代生物技术手段如MAS等将水稻野生近缘种中的有利基因转移到现有超高产杂交稻亲本中，这些有利基因不仅可直接改良水稻产量性状、抗性等，还可增加现代栽培品种的遗传多样性，有利于进一步提高水稻杂种优势利用水平。因此，近年来MAS已成为植物育种领域的研究热点之一。然而，应清醒地认识到，分子标记技术只是起辅助作用，辅助选择还离不开常规育种手段。就目前的发展现状而言，分子标记辅助育种的理论问题已研究不少，

29、但实际应用分子标记于具体的育种项目还处于进一步探索阶段。本项目的初步成功，在水稻产量性状遗传改良方面是一种突破性进展，展示了该领域的诱人前景，但今后还必须作更深入的研究，以证实这一新途径的广泛育种价值。致谢本研究获得国家高技术研究发展计划(2001AA211071-3)，国家自然科学基金(30270819)和湖南省自然科学基金(00JJY1003)资助; 本研究的早期材料收集和构建得到美国洛克菲勒（the Rockefeller Foundation）基金资助。在此一并致谢。参考文献：1. Khush G S, Ling K C, Aquino R C, et al. Breeding for

30、 resistance to grassy stunt in riceA. Proceedings of the 3rd International Congress of the Society for the Advancement of Breeding Researchers in Asia and Oceania (SABRAO). Plant Breeding Paper 1(4)C. Canberra, Australia, Australian National University. 1977. 3-9.2. Plucknett D L, Smith N J H, Willi

31、ams J T et al. A case study in rice germplasm: IR36A. Gene Banks and The Worlds FoodC. Princeton University Press, Princeton, NJ., 1987: 171-185.3. Lin S C, Yuan L P. Innovative Approaches to Rice ImprovementJ. Manila, Philippines: IRRI, 1980: 35-51.4. Li Z, Zhu Y. Rice male sterile cytoplasm and fe

32、rtility restoration, Hybrid Rice. International Rice Research Institute. Manila, Philippines. 1988: 85-102.5. Chen Sheng, Lin Xinghua, Xu Caiguo, et al. Marker-assisted selection to improve bacterial blight resistance of Minghui 63, an elite restorer of hybrid riceA. Eighteenth international congres

33、s of genetics (Abstracts)C, Beijing, Chinese Academy of Sciences. 1998: 158.6. Huang N, Angeles E R, Domingo J, et al. Pyramiding of bacterial blight resistance genes in rice: marker-assisted selection using RFLP and PCRJ. Thero Appl Genet, 1997,95: 313-320.7. Paterson A H, DeVerna J W, Lanini B, et

34、 al. Fine mapping of quantitative trait loci using selected overlapping recombinant chromosomes in an interspecies cross of tomatoJ. Genetics, 1990,124: 735-742.8. Xiao Jinhua, Li Jiming, Silvana Grandillo, et al. Genes from wild rice improve yieldJ. Nature, 1996, 384: 223-224.9. Xiao Jinhua, Li Jim

35、ing, Silvana Grandillo, et al. Identification of trait-improving quantitative trait loci alleles from a wild rice relative, Oryza rufipogonJ. Genetics, 1998, 150: 899-909.10. Moncada P, Martínez C P, Borrero J, et al. Quantitative trait loci for yield and yield components in an Oryza sativa

36、5;Oryza rufipogon BC2F2 population evaluated in an upland environmentJ. Theor Appl Genet, 2001,102: 41-52.11. 李德军, 孙传清, 付永彩, 等. 利用AB-QTL法定位江西东乡野生稻中的高产基因J. 科学通报，2002,11: 854-858.12. Melchinger A E. Use of molecular markers in breeding for oligogenic disease resistanceJ. Plant Breed , 1990,104:1-19. 13. Tanksley S D. Molecular markers in plant breedingJ. Plant Mol Biol Rep, 1983,1: 3-8. 14. Hillel J, Schaap T, Haberfeld A, et al. DNA fingerprint appli