慢病毒介导RNA干扰抑制肺腺癌细胞HMGA1表达对化疗敏感性的影响

1、慢病毒介导 RNA 干扰抑制肺腺癌细胞 HMGA1 表达对化疗敏感性的影响摘要：目的：探讨慢病毒介导的 RNA 干扰沉默 HMGA1 对肺腺癌细胞株 SPCA-1 化疗敏感性的影响。方法：制备 HMGA1siRNA 慢病毒载体，PCR 筛选阳性克隆，测序鉴定；转染肺癌细胞株 SPCA-1 后，半定量 RT-PCR 和 Western blot 检测其对细胞 HMGA1 基因表达的影响；MTT 实验检测吉西他滨对阳性组和阴性组细胞生长、增殖的影响；流式细胞仪检测两组细胞凋亡率。结果: PCR 和测序证实，成功构建 HMGA1siRNA 的慢病毒载体；RT-PCR 和 Westernblot 证实

2、阳性组细胞存在 HMGA1 基因表达下调；分别用不同浓度的吉西他滨处理两组细胞 72h后,MTT 显示阳性组细胞生长抑制率较阴性组细胞明显增高；用 0.05 ug/ml、0.5 ug/ml、5ug/ml 吉西他滨处理细胞 72h 后,流式细胞仪检测,阳性组细胞凋亡率较转染阴性组细胞增加。结论: HMGA1siRNA 能特异性下调细胞 SPCA-1 中HMGA1 的表达，增强了该肺腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。关键词：RNA 干扰；HMGA1；吉西他滨；肺腺癌中图分类号：R730.53 文献标识码： A在我国肺癌发病率和死亡率均较高,化疗在肺癌的综合治疗中占有重要地位,但癌细胞中某些基因的表达是影

3、响其疗效的主要原因之一。高迁移率族蛋白组A1（high mobility groupA1,HMGA1）可能是一种癌基因，它能促进细胞恶性转化、肿瘤细胞增殖和侵袭，抑制其凋亡。近年来, RNA 干扰(RNA interference,RNAi)技术的出现,为研究内源性基因功能和信号转导途径提供了强有力的研究工具。本研究旨在构建 HMGA1siRNA 慢病毒载体并转染肺腺癌细胞 SPCA-1,沉默HMGA1 的表达，观察其对细胞化疗敏感性的影响.1 材料与方法1.1 材料与试剂慢病毒载体系统(上海吉凯基因公司)；吉西他滨（江苏豪森药业股份有限公司）；RPMI1640（GIBCO 公司）；HEPES

4、(Amresco 公司)；胎牛血清（天津TBD 公司）；四甲基偶氮唑蓝（MTT,美国 Siga 公司）；Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基公司）；Trizol(美国 Invitrogen 公司)和 TaKaRaRNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(大连宝生物公司)；羊抗人 HMGA1 多抗(Santa Cruz公司) ,小鼠抗羊 IgG 购自北京中杉公司；人肺腺癌细胞株 SPCA-1、慢病毒的包装细胞 293T 细胞株和大肠杆菌菌株 DH5(中科院上海细胞库)。1.2 细胞培养人肺腺癌细胞株 SPCA-1 于含 10胎牛血清的 RPMI1640 培养液中培养，

5、置于 37下 5CO2 水饱和培养箱中。细胞贴壁生长良好，每 3 天传代一次。1.3 人 HMGA1 基因 shRNA 模板序列的设计前期实验筛选出最有效的 HMGA1 siRNA(siHMGA1) 序列是:AAACCACCACAACTCCAGGAA。以此序列为模板,根据碱基互补配对原则设计寡核苷酸链，在互补两条序列中间加入 Loop,序列为 TTCAAGAGA，使寡核苷酸可以形成发夹结构,寡核苷酸序列两端分别带有酶切位点。正义链：5-TAAACCACCACAACTCCAGGAATTCAAGAGATTCCTGGAGTTGTGGTGGTTTTTTTTTC-3；反义链：:5-TCGAGAAAAAA

6、AAACCACCACAACTCCAGGAATCTCTTGAATTCCTGGAGTTGTGGTGGTTTA-3。阴性对照双链寡核苷酸转录产物所形成的 siRNA 的作用序列为：5-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3此序列不与任何人类基因序列同源。1.4 实验方法1.4.1 siHMGA1 慢病毒表达载体的构建按照设计好的双链 DNA 进行合成、退火,DNA 稀释到 1g/l ,退火反应体系如下:DNA 模板单链正义链 5l,DNA 模板单链反义链 5l,5UniversalBuffer 20l ,ddH2O 70l,总体积 100ul 混匀,90温育 4 分钟，70温育10 分钟，缓慢冷

7、却至室温，稀释至终浓度 100 ng/l。将退火产物与线性化处理的载体片段连接,将连接产物转化到 DH5感受态细胞,将 150l 已转化的感受态细胞转移到含 20mmolL MgSO4 和 Amp 抗性的 SOB 琼脂培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平皿，于 37培养 16 小时进行阳性克隆筛选。1.4.2 PCR 和 DNA 测序鉴定挑取 10 个单菌落,使用载体多克隆位点两端的引物进行 PCR 扩增,其中上游引物：5-GCCCCGGTTAATTTGCATAT -3；下游引物：5-GTAATACGGTTATCCACGCG -3。(1)PCR 体系如下：上下游引物各 0.4ul,M

8、gCl20.5l , Taq polymerase 0.2l , DNTPs(2.5mM)0.8l ,ddH2O14.7l,10buffer 2.0ul, Template 1ul。(2) PCR 反应条件如下：94预变性 2min,94变性 30 sec,60退火 30 sec,72延伸 30 sec（从第二到第四步共 30cycle）,最后 72延伸 6min。 PCR 反应结束后,取 PCR 产物 5l 上样,进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳。挑选阳性克隆,接菌,过夜培养后,使用质粒抽提试剂盒提取质粒,抽提好的质粒使用载体上的引物送测序(上海英俊公司完成)。1.4.3 携带 siHMGA1

9、的慢病毒重组体的包装胰蛋白酶消化对数生长期的 293T 细胞,调整细胞密度为 0.6109/ L 接种于 15ml 的细胞培养瓶中,37、5CO2 培养箱内培养,细胞密度达 70-80时进行转染。使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒质粒共转染 293T 细胞，转染后 48h ,收集细胞上清液,4、4000r/min 离心 10min 除去细胞碎片 ,以 0.45m 滤器过滤上清液于 40ml 超速离心管中。把病毒粗提液样品加入到过滤杯中并盖上盖子，将过滤杯插到含滤过液收集管中,4000r/ min 离心约 10-15分钟，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，过滤杯中的即为病毒浓

10、缩液。将病毒浓缩液分装到病毒保存管中，-70保存。1.4.4 细胞转染胰蛋白酶消化对数生长期的 SPCA-1 细胞,调整细胞密度为 0.6109/ L 接种于 15ml 的细胞培养瓶中,37、5CO2 培养箱内培养,细胞密度达 70-80时进行转染。构建好的 HMGA1siRNA 慢病毒质粒和阴性 siRNA 慢病毒质粒按 MOI值 50 转染 SPCA-1 细胞，并分为阳性组、阴性组和空白组(未转染的细胞)，转染后 4 天,显微镜下观察细胞生长良好。1.4.5 RT-PCR 检测 HMGA1mRNA 表达各组对数生长期的细胞用 Trizol 试剂盒（Invitrogen 公司）抽提总 RNA

11、。RT-PCR 步骤按照 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0 说明书进行。HMGA1 引物序列为 5/-CTACTTTGCTTCCGCCACTC-3/ , 5/-GTGGCCCCTACACCCTTTAT-3/，扩增长度为 419bp；内参-actin 引物序列为 5/-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3/,5/-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3/,扩增长度为 621bp。以上引物均由上海生物工程公司合成。RT 条件：42 30min，995min，5 5min。PCR 条件：942min,94 30s,59 30s,72 30s，28 个循环

12、，72延伸 10min。PCR 产物经1.5琼脂糖凝胶电泳（100V,30min）。Imagemaster VDS 凝胶成像系统成像。1.4.6 Western 印迹检测 HMGA1 蛋白表达用细胞裂解缓冲液裂解细胞, BCA 蛋白定量试剂盒检测总蛋白浓度。取 20g 蛋白经 1 0%聚丙稀酰胺凝胶电泳, 1 2 0V 恒定电压转膜 2 h , 室温封闭1 h , 4 封闭过夜。HMGA1 一抗工作浓度为 1:500, 作用 1 h; 二抗工作浓度1:1000 , 作用 50min , -actin 一抗工作浓度为 160 0 , 二抗工作浓度为1:1000 , 抗体的反应时间同 HMGA1。

13、然后按说明书滴加 ECL 发光液, 反应 5min后, 入暗室曝光 1 0min , 显影、照相。1.4.7 MTT 检测细胞增殖情况取阳性组和阴性组指数生长期细胞以 5000 个细胞/孔接种于 96 孔培养板中，每组设 6 个复孔，24h 后换为含不同浓度吉西他滨（0.005ug/ml、0.05ug/ml、0.5 ug/ml、5ug/ml、50 ug/ml）的培养液，并设空白对照组和阴性对照组。培养 72h 后每孔加 MTT20ul(5mg/ml)再培养 4h，弃上清，加入 150ul 二甲基亚砜（DMSO），振荡 10min，使结晶物充分溶解。置酶联免疫检测仪上，570nm 波长下，以空白

14、孔调零，测定各孔光吸收值（A）。按下列公式计算细胞抑制率：抑制率（1给药组平均 A 值/对照组平均 A 值）100%1.4.8 流式细胞术检测将阳性组和阴性组指数生长期的细胞培养 24h 后，换成含不同浓度吉西他滨（0.05 ug/ml、0.5 ug/ml、5ug/ml）的培养液干预 72h 后收集约 106 细胞，用 PBS 洗涤细胞 2 次。按试剂盒说明操作后上流式细胞仪检测。1.5 统计学分析结果中的定量数据以均数标准差（xs）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两两组间差异比较采用 SNK 检验，P0.05 有统计学差异。所有数据由统计软件 SPSS13.0 进行统计学分析。2 结果

15、2.1 携带目的基因慢病毒质粒的鉴定2.1.1 PCR 结果PCR 反应结束后,取产物 5l 上样,1.5%琼脂糖凝胶电泳, 重组慢病毒载体的 PCR 产物是 381bp(插入片段 59bp),经双酶切后没有插入片段的 pGCL-GFP 空载体 PCR 产物是 322bp,鉴定结果与预期相符,结果如图 1。2.1.2 DNA 测序鉴定DNA 测序的结果与实验要求的 DNA 序列完全一致(图 2)。对于测序结果正确的克隆,进行不含内毒素质粒的提取，提取完成之后,用蛋白核酸测定仪(Eppendorf,PS232C) 测量 Lentivector-siHMGA1 plasmid DNA ,D260/

16、D280 值为 1.9 ,表明我们获得了纯度和完整性均较高的质粒 DNA。2.2 RNAi 下调 SPCA-1 细胞 HMGA1mRNA 的表达水平半定量 RT-PCR 结果以琼脂糖凝胶电泳条带的亮度来判断 HMGA1 的 mRNA 表达高低，结果显示阳性组 HMGA1mRNA 的表达量明显低于阴性组和空白组(后两组间没有差别 p0.05)，说明干扰的效率很高(图 3)。2.3 RNAi 下调 SPCA-1 细胞 HMGA1 蛋白的表达水平Western blot 的结果以蛋白条带的亮度来判断 HMGA1 的蛋白表达高低，结果显示阳性组 HMGA1mRNA 的表达量明显低于阴性组和空白组,说明

17、干扰的效率很高(图 4)。2.4 吉西他滨对阳性组、阴性组细胞的体外增殖抑制效应分别以 0.005ug/ml、0.05 ug/ml、0.5 ug/ml、5ug/ml、50 ug/ml 吉西他滨处理各组细胞 72h 后,阳性组较阴性组抑制率明显升高 (图 5)。根据 MTT 吸光值计算 IC50 值,阳性组是 0.3090.003ug/ml，阴性组是 0.6530.003ug/ml,两组间具有差异性(p0.05)。2.5 吉西他滨对阳性组和阴性组细胞凋亡率的影响细胞经 0.05 ug/ml、0.5 ug/ml 和 0.5 ug/ml 吉西他滨处理 72h 后，阳性组凋亡率分别为 9.530.42

18、%、16.670.45%、25.400.79%，阴性组凋亡率分别为 7.430.21%、11.000.20%、14.930.31%,差异具有显著性p0.05，见图 6。3 讨论慢 病 毒 介 导 的 RNA 干扰(RNA interference,RNAi) 是由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)引发的转录后基因沉默机制(posttranscriptional gene silencing,PFGS)。dsRNA 经 RNA 沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex,RISC)降解成 21-23nt 的小干扰RNA(shortInterf

19、erence RNA，siRNA)，并以其为模板，特定位点和特定间隔地降解与之序列互补的 mRNA。RNAi 具有快速、有效、容易操作和序列特异性强等优点。近年来的研究表明以慢病毒为载体可以明显增加 RNA 干扰的转染和干扰效率1。因此，本实验选择慢病毒为载体。本实验结果表明，通过慢病毒转染 HMGA1 基因的干扰序列到肺癌细胞后，无论是在 RNA 水平和蛋白水平目的基因几乎不表达，说明该种方法效率高、可操作性强。成功的下调肺癌细胞中 HMGA1 基因的表达为我们后面的实验奠定了基础。人的 HMGA1 基因是高迁移率族蛋白 HMG（high mobility group protein）中的一

20、员，又称为 HMGI（Y）基因，位于染色体的 6p21。研究表明正常成年个体组织中 HMGI(Y) 基因很少表达甚至不表达,然而在胚胎的发育过程中和恶性肿瘤中的表达水平却很高，而且一般来说，HMGI (Y) 基因表达水平的高低与肿瘤的恶性程度有关2。这与它的结构和功能有关，它最显著的特点是拥有三个相似但又相互独立的特殊结构，该结构能和 DNA 中富含 A-T 序列的小沟结合，称为 A-T 沟序列，它含有三个碱性八肽的 DNA 结合模体，该模体的核心结构是BBXRGRXB ,B(G 或 R)代表碱性氨基酸,X 是甘氨酸或脯氨酸3。这类蛋白质通过 A-T 沟序列优先与 DNA 小沟中富含 AT 的

21、序列结合, 诱导增强子所调控的启动子发生结构特异性的变化,使相应的转录因子在同一识别位点与大沟发生相互作用,或者直接与 HMGI(Y) 蛋白发生作用,从而进一步增强转录，调控肿瘤相关基因表达和细胞分化4,5。从而使正常细胞恶变和转化，肿瘤细胞侵袭和转移。本实验 RT-PCR 和 Western blot 证明该基因在肺癌细胞中的表达也很高，表明HMGA1 基因可能对肺癌细胞生长、分化和恶变起到调控作用，有可能是肺腺癌细胞发生发展的关键因子之一。当通过 RNA 干扰技术下调肺癌细胞中的 HMGA1 基因表达后，在吉西他滨的干预下阳性组生长抑制率明显高于阴性组进一步说明：一方面该基因可能调控肺癌细

22、胞分化、生长和增殖以及肿瘤细胞相关基因表达,当它表达下调后,吉西他滨抑制阳性组细胞生长的能力相对增强；另一方面说明该基因是影响肺癌细胞化疗敏感性的重要基因之一。后者与近年来文献的报道是一致的6。研究还发现在相同浓度吉西他滨的作用下，低表达 HMGA1 的阳性组比高表达 HMGA1 阴性组凋亡率要高，表明 HMGA1 基因表达下调后药物敏感性的改变可能是和细胞凋亡机制有关。近年来，研究表明 HMGA1 具有抗凋亡的作用，其具体抑制凋亡的机制还不是很清楚，可能是通过作用于凋亡基因 P53 的活化剂 HIPK2，阻止它进入细胞核，抑制它的活化，从而抑制 P53 基因的功能，阻止细胞凋亡7,8 ；也可

23、能是通过激活磷脂酰肌醇 3 激酶和(或)蛋白激酶 B 信号途径(PI3K/Akt)中的 Akt，后者进一步抑制凋亡蛋白酶 Caspase-3 和 Caspase-9 的活性，从而抑制细胞凋亡6。另外,吉西他滨抗肿瘤作用之一就是诱导细胞凋亡。所以，当肺癌细胞中的 HMGA1 表达下调后，其抗凋亡作用减弱，吉西他滨诱导阳性组细胞凋亡的比例增加。综上所述，HMGA1 基因表达下调后能够增加肺癌细胞对吉西他滨的敏感性，其机制可能和抑制其抗凋亡作用有关，具体的信号途径还不是很清楚，有待进一步研究。参考文献1 金婧,包新华，潘虹，等.大鼠 MeCP22shRNA 慢病毒表达载体的构建与鉴定J.山西医科大学

24、学报，2007，38(5)：393-3972 Chang ZG,Yang LY,Wang W,et al.Determination of High MobilityGroup A1(HMGA1) expression inhepatocellular carcinoma:a potentialprognostic markerJ.Digestive diseases andsciences,2005,50(10):1764-1770.3 Duncan.HMGA1 mediates the activation of the CRYAB promoter byBRG1J. DNA CellBiol,2007,26(10):745-752.4 Briese J, Radde J, Schulte HM, et al.Expression of the high-mobility group protein HMGI(Y) in gestationaltrophoblasticdiseasesJ.Int J Gy