miRNA 及其荧光定量PCR检测

1、 microRNA 及其Real time PCR检测北京康为世纪生物技术有限公司 microRNA,A hot zone of research!2009年2010年 microRNAmicroRNA （miRNA ）长度2024nt 单链小分子RNA广泛存在于各种真核细胞中不编码任何蛋白质其基因常位于基因组非编码区内源性表达，表达具时序性和组织特异性。与目标基因mRNA 相互作用，调控其表达水平在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用 分子功能22 nt单链小RNA与目标基因3端非编码区的识别位点相结合导致目标基因mRNA 分子稳定性下降，半衰期变短，或mRNA 分子结构变化

2、（5脱帽），从而表达水平下降miRNA 作用靶点mRNA 5cap编码区AAAAAAAA 3 microRNA 的来源 miRNA 前体与成熟体 microRNA 识别靶点不严格互补配对一个miRNA 可调节多个基因一个基因可受多个miRNA 调控60%人类蛋白基因受miRNA 调控 miRNA 与siRNA 的异同分子形式无区别，都是由Dicer 产生的22nt小分子分子功能近似，都导致目标基因表达水平下降。但通常siRNA 效果更剧烈产生来源不同。miRNA 有其基因，内源性表达siRNA 多数情况下为人工外源导入 miRNA siRNA 命名规则成熟体microRNA 命名规则micro

3、RNA 成熟体传统名字：如let7家族成员：加a ，b, c后缀，如let-7a 主要产物：种名-miR-序号, 如，has-miR-56次要产物：加星号后缀，如，has-miR-56*主次不明：以5或3端区分，如，miR-142-5p (5 端产物 和miR-142-3p (3端产物arm (老命名miR-142-s and miR-142-as. miRNA 分子功能总结以非严格互补配对方式识别靶基因3端非翻译区，只有8nt的种子区（seed region）严格互补配对。一种miRNA 分子可以不同威力调控多个靶基因，通常导致靶基因mRNA 稳定性降低及其它翻译水平的表达下降（如，脱帽）。

4、通常不导致mRNA 剧烈降解。有个别报告miRNAs 与5端非翻译区结合导致靶基因上调表达。在植物中miRNA 的分子功能可与siRNA 相似，与目标靶点严格互补配对，导致目标基因mRNA 分子急剧降解。 2010年初数据库（v.14）包括物种：115人miRNA ：721小鼠miRNA: 579大鼠miRNA ：325拟南芥miRNA ：1902011年初数据库（v.16）包括物种：142人miRNA ：1048小鼠miRNA : 672大鼠miRNA ：408miRBase version 14拟南芥miRNA ：213miRNA annotationA uniform system fo

5、r microRNA annotation. Ambros V, Bartel B, Bartel DP, Burge CB, Carrington JC, Chen X, Dreyfuss G, Eddy SR, Griffiths-Jones S, Marshall M, Matzke M, Ruvkun G, Tuschl T. RNA2003 9(3:277-279 Expression criteriaA. Detection of a distinct 22-nt RNA transcript by hybridization to a size-fractionated RNA

6、sample (ordinarily by the Northern blotting method.B. Identification of the 22-nt sequence in a library of cDNAs made from size-fractionated RNA. Such sequences must precisely match the genomic sequence of the organism from which they were cloned (except as noted below.Biogenesis criteriaC. Predicti

7、on of a potential fold-back precursor structure that contains the 22-nt miRNA sequence within one arm of the hairpin. In this criterion, the hairpin must be the folding alternative with the lowest free energy, as predicted by mfold (Mathews et al. 1999 or another conventional RNA-folding program, an

8、d must include at least 16 bp involving the first 22 nt of the miRNA and the other arm of the hairpin. It should not contain large internal loops or bulges, particularly not large asymmetricbulges. In animals, these fold-back precursors are usually about 6080 nt, whereas in plants, they are more var

9、iable, and may include up to a few hundred nucleotides.D. Phylogenetic conservation of the 22-nt miRNA sequence and its predicted fold-back precursor secondary structure. The conserved hairpin should meet the same minimal pairing requirements as in criterion C, but need not be the lowest free energy

10、 folding alternative.E. Detection of increased precursor accumulation in organisms with reduced Dicer function. miRNA 检测与定量经典方法:放射标记Northern 杂交 miRNA 芯片基因表达谱基本原理：某物种全部已知miRNA 集中于一张芯片。点杂交检测各miRNA 丰度所回答的问题：哪些miRNA 是你所应该关注的优点：高通量，全景观察缺点：敏感度、特异性均有限，适用于初筛需后续验证：qPCR miRNA 主要检测技术 Pri-miRNA 检测必要性：不排除miRNA 从

11、前体到成熟体，从核内转运到核外的过程中存在调控机制的可能。 Specific miRNA quantification by real time PCR way to go关键难点太短解决办法: 加长丰度低解决办法:小RNA 提取序列高度相似miRNA 之间难以区分解决办法: 特殊设计的检测方法；小心设计引物与反应优化 解决miRNA 丰度难题-小RNA 提取基本原理影响RNA 分子与硅胶柱结合的因素chaotropic agent ，如，盐酸胍离子强度，如NaCl小分子有机溶剂，如乙醇精心调整各组份配比，达成大、小RNA 与硅胶柱结合的区分条件，分离去除大分子量RNA ，富集小分子量RNA

12、。 提取小分子量RNAM ：Marker#1：康为柱式分离的小片段RNA#2：康为柱式分离的总RNA#3：沉淀法得到的总RNA 成熟miRNA qPCR检测-Poly(A加尾法优点：简单直接，高效。一次逆转录获得的cDNA 可用于多个目标分子的检测。成熟miRNA qPCR检测 茎环法优点：特异引物逆转录，理论上效率更高，检测更灵敏缺点：茎环引物设计复杂；特异引物逆转录不便多基因检测 检测方法选择依样本特性，检测目标多寡而定康为技术服务经验举例：复旦大学某客户miRNA 芯片提示10个miRNA 在病人与正常人之间有显著差异表达要求从66个外周血RNA 样本中检测这10个miRNA 加尾法，5

13、个目标获得良好检测颈环法，4个目标获得良好检测1个目标的检测很难，尝试多种引物设计，调整反应体系 其它检测原理 其它检测原理 microRNA 检测难题 康为miRNA 产品小RNA 提取试剂盒CW0627加尾法miRNA cDNA第一链合成试剂盒CW2141miRNA 荧光定量PCR 检测试剂盒CW2142荧光定量技术服务项目 荧光定量PCR服务项目 荧光定量PCR服务 相对定量 -SYBR Green 染料法 相对定量 -TaqMan 探针法 绝对定量 - TA克隆制备标准品 miRNA荧光定量服务 miRNA荧光定量 - 加尾法（SYBR Green法） miRNA荧光定量 - 茎环法（SYBR Green法） miRNA荧光定量 - 茎环法（TaqMan法） 荧光定量技术服务优势 p 荧光定量PCR康为世纪拥有五台世界主流的荧光定量PCR仪。 ABI7500（两台）、ABI7900、Roche480（