再生障碍性贫血与丙型和戊型肝炎病毒相关性的研究

1、    再生障碍性贫血与丙型和戊型肝炎病毒相关性的研究        摘要目的和方法：采用RTPCR和定量酶标标准化的测定方法，检测了先患(丙型或戊型)肝炎后患再生障碍性贫血和先患再生障碍性贫血后患丙型(或戊型)肝炎的阳性率，并与对照组比较。结果：血清组中HCVRNA的阳性率分别是57.9%和28.9%，二者差异显著(P0.05)；HEVRNA阳性率分别是24%和25.9%，二者差异不显著(P0.05)。在单个核细胞组中HCVRNA阳性率分别为11.8%和10.5%；HEVR

2、NA的阳性率分别为0%和3.7%；HEVRNA在粪便中的阳性率32%和37%，均无显著差异。结论：丙型和戊型肝炎病毒不直接影响造血细胞的基因表达，仅使造血微环境有一定改变，引起患者自身免疫反应，对造血有一定的影响。主题词肝炎病毒，戊型；肝炎病毒，丙型；贫血，再生障碍性 The study on the relativity between hepatitis virus C orE(HCV,HEV) and the occurrance by applying RT/PCR technology to aplastic anemiaGUO Xiu-Zhi,FAN HongTao,LIANG S

3、hi,TAN Guang-Xiao,YANG LiJianDept.of Hematology,Medical College of Jinan University,Guangzhou(510632)Abstract AIM and METHOD:Virus infection may be one of the causes of aplastic anemia(AA).We adopt the RT/PCR technology to examine the positive rate of HCVRNA(or HEVRNA）for the purpose to reveal the r

4、elativity associated with the occurrance of AA.RESULTS:In two serum groups,the positive rates of HCVRNA，those followed by AA(called irrelevant AA),those and AA followed by the hepatitis virus C(called relevant AA),are 57.9% and 28.9% respectively,the difference appears significant(P0.05)，the positiv

5、e rate of HEV-RNA is 24% and 25%,while the difference is not stricking(P0.05).However,in mononuclear cell,the positive rate of HCV-RNA is 11.8% and 10.5%,HEV-RNA is 0% and 3.7% respectively,meanwhile,in stool,HEV-RNA is 32% and 37%,all are not stricking(P0.05).CONCLUSION：The occurrance of AA is not

6、related to virus C and E directly,but virus may activate autoimmune response,which makes influence on micro circulation and interferes with hematopoietic function.MeSHHepatitis E virus;Hepatitis C virus;Anemia,aplastic国内丙型和戊型肝炎病毒的感染率较高，尤其是输血后患丙型肝炎的发病率有增高的趋势。本文用RTPCR国际标准化酶标的方法检测再生障碍性贫血(简称再障)患者血清和单个核细

7、胞提取物中的HCVRNA(hepatitis C virus-RNA)和HEVRNA(hepatitis E virus-RNA)的阳性率，并对丙型(或戊型)肝炎有关再障和无关再障及正常人进行比较。材料与方法一、病例的选择：19911997年间临床已确诊1为再生障碍性贫血的患者，分成两组：(A)组为先患丙肝(或戊肝)后患再障，共34例(或25例)，其中男22例(戊肝18例)；女12例(戊肝7例)；年龄1442岁，平均年龄29.2岁(戊肝28.1岁)。(B)组为先患再障后患丙肝(或戊肝)38例(戊肝27例)，其中男18例，女20例(戊肝男13例，女14例)。正常对照组为25名献血员，男15例，女

8、10例，平均年龄24.1岁(1930岁)。先患肝炎后患再障，一般为再障发病前3个月以上患典型的肝炎症状，符合1990年全国病毒性肝炎学术会议修订的标准诊断。二、试剂与仪器：PCR扩增仪是美国PE公司生产的CTI型。HCVPCR试剂和酶标试剂均由黄道培先生(美国CLL公司)惠赠；HEVPCR试剂盒由华美公司购入。HCVPCR引物F1：5CGACACTCCACCATAGATCAC3。R1：5ATGGAGCACGGTCTACGAGAG3。F2：5TGTGAGGAACTACTGTCTTCA3。R2：5CCTATCAGGCAGTACCACAAG3。HEVPCR引物P1：5GCTATTATGGAGGAGT

9、GTGG3。R1：5CAGGGCCCCAATTCTTCTC3。P2：5GCGTGGATCTTGCAGGCC3。R2：5TTCAACTTCAAGCCACAGCC3。三、样品处理：取静脉血3 mL，2 mL加肝素抗凝，用淋巴细胞分层液按常规分离单个核细胞，取1×105450nm读OD值，结果计算：样品阴性对照(本底)A4500.25;样品阳性对照为A4500.41.0；样品测定值为A450A450本底值0.4以上为阳性。结果一、血清：1.先患丙肝后患再障的有关再障组患者酶标测定A450平均值0.67(0.450.85)，电泳结果阳性(HCVPCR阳性)18例，占1834为52.9%；先患

10、再障后患丙肝的无关再障患者酶标A450值平均0.62(0.420.85)，电泳阳性的11例，占1138为28.9%，二者比较差异显著(P0.01)。2.先患戊肝后患再障的患者中HEVPCR酶标测定A450在0.40以上只有6例，平均值0.65(0.450.78)，电泳阳性6例，占625为24%，先患再障后患戊肝的无关再障患者中HEVPCR酶标测定A450为0.4以上7例，平均值0.62（0.440.72)，电泳阳性7例，占727为25.9%，二者比较差异不显著(P0.05)。二、单个核细胞：1.丙肝有关再障患者酶标测定A450平均值0.65（0.410.82)，电泳结果阳性4例占11.8%；无

11、关“再障”酶标测定A450为0.65(0.410.79)，电泳阳性4例，占10.5%，二者相比较差异不显著(P0.5)。2.戊肝“有关”再障患者酶标测定A450值平均0.38(0.250.40)，电泳27例均为阴性，即0%。戊肝无关再障患者酶标测定A450平均值为0.47(0.20.57)，电泳阳性仅1例，占3.7%。二者比较差异不显著。    Fig 1RTPCR electrophoresis result of HCVRNALane 1：Positive control of MNC HCVRNALane 2：Positive control of

12、 serum HCVRNALane 3,7,8：Positive samples of MNC HCVRNALane 4，5，6：Positive samples of serum HCVRNALane 9,10：Negative control of MNC HCVRNALane 11,12：Negative control of serum HCVRNA1丙型肝炎病毒RTPCR电泳结果    Fig 2RTPCR electrophoresis result of HEVRNALane 1：Positive control of MNC HEVRNA

13、Lane 2：Positive control of serum HEV-RNALane 3，8：Positive samples of MNC HEVRNALane 4，5，6：Positive samples of serum HEVRNALane 9,10：Negative control of MCN HEVRNALane 11：Negative control of serum HEVRNA表1RTPCR检测结果Tab 1RTPCR detection resultGroupnSerumMNCPositivecasesPostiverate(%)PositivecasesPostiv

14、erate(%)AA relatedto hepatitis B341852.9411.8AA unrelatedto hepatitis B381128.9410.5AA relatedto hepatitis E25624.000AA unrelatedto hepatitis E27725.913.7     AA：aplastic anemia 3.粪便中检查结果：戊肝有关再障和无关再障的阳性率(HEVPCR）分别为32%和37%。二者无显著差异(P0.5)。讨论再生障碍性贫血(简称再障)的病因已研究多年，至今尚不十分清楚。叶子青等研究登革热病毒

15、对骨髓造血有一定的抑制作用2。郭秀枝等用丙型肝炎患者的血清加入正常人的细胞培养中，观察到对正常淋巴细胞生长有一定抑制作用。不仅集落数量少，且集落小3。说明病毒感染对造血细胞生长有一定的影响。用PCR的方法检测“乙型肝炎病毒与再障的相关性”结果说明：乙型肝炎病毒对造血有直接影响作用，其病毒DNA可整合在单个核细胞DNA上，抑制造血细胞生长。用RTPCR的方法检测丙肝和戊肝有关再障和无关再障，在血清中丙肝有关再障阳性率52.9%，无关再障28.9%，二者差异显著(P0.01)。而戊肝有关和无关再障二者间差异不显著。在单个核细胞中，无论是丙肝或是戊肝的有关再障和无关再障之间均无显著差异。顾长海等与Read等认为丙型肝炎病毒致病作用是细胞免疫和抗体依赖性细胞毒(ADCC)性损害，这种免疫损害反应不仅能损害造血组织，且抑制造血功能4，5。由于病毒的感染，会使单核巨噬细胞功能紊乱和成熟障碍。白细胞介素I(ILI）来源于激活的巨噬细胞、内皮细胞等，引起ILI功能失调，导致成纤