川芎嗪对再生障碍性贫血小鼠骨髓细胞粘附分子作用研究(精)

1、川芎嗪对再生障碍性贫血小鼠骨髓细胞 粘附分子作用研究【摘要】目的 探讨免疫介导再生障碍性贫血(再障)小鼠骨髓细胞粘附分子表达及川芎嗪对其影响。方法 建立免疫介导的再障小鼠模型，腹腔注射磷酸川芎嗪注射液，每次5 mg,每日2次,第14天用流式细胞仪检测小鼠骨 髓单个核细胞CD9d、CDfee的表达水平，用免疫组织化学SABC方法检测骨髓基质 细胞VCAM-啲表达。结果 27只BALB/c小鼠，平均分为3组。再障组CDfed、 CD9e、VCAM-1的表达均显著低于正常组(t=11.96,17.18 和7.09 ； P均0.001), 而川芎嗪组其表达均显著高于再障组(t=9.05,14.61 和

2、6.91 ； P均0.001),且 CD9e和VCAM-1已近正常。结论川芎嗪能增强免疫介导再障小鼠骨髓造血细胞 和基质细胞粘附分子的表达，有利于造血细胞的增生。【关键词】贫血，再生障碍性 胞间粘附分子 造血系统 川芎嗪Study on the effect of ligustraz ine on adhere nt moleculeexp ressi on of bone marrow cells in immun e-mediated ap lastican emia miceDONG Li ngli,LIU Wen li,SUN Han yi ng,et al.De partme nt

3、of In ternalMedici ne, Tongji Hos pital,To ngji Medical Un iversity,Wuha n430030【Abstract 】 Objective To explore the effect of ligustrazine on the exp ressi on of adhere nt molecule of bone marrow cells in immune- mediated ap lastic an emia(AA) mice.Methods Each immun e-mediated AAmouse was in tra p

4、erit on eally injected with 5 mg ligustraz ine twice a day. On the 14th day,ex pressi ons of CD 49d and CD49e in bone marrow mononu clear cells(MNC) were detected by flow cytometry,a nd VCAM-1 on stromal cells by immuno histochemistry SABC. ResultsExp ressi ons ofCD9d,CD49e and VCAM-1 were sig nific

5、a ntly lower in AA group than in normal grou p(t=11.96,17.18 and 7.09 res pectively, Pv0.001),a nd were much higher in ligustraz ine treated group tha n in non-treated grou p(t=9.05,14.61 and 6.91 res pctively, Pv0.001).Ex pressio ns of CD49dand VCAM-1 were in the no rmal range in ligustraz ine grou

6、p.Con clusi onsLigustraz ine can in crease the exp ressi on of adhere nt molecule of bone marrow cells in immun e-mediated AA mice,thus p romote the growth of hemat opo ietic cells.【Key words 】 Anemia,aplastiC InterCellular adhesion moleCule Hematopoietic system Ligustrazine造血干细胞的增殖和分化高度依赖骨髓微环境产生的调节

7、分子的相互作用 其中 , 造血干细胞的粘附受体与基质细胞和细胞外基质上的粘附配体起关键作用 1。为此, 我们研究了免疫介导再生障碍性贫血 (再障)小鼠骨髓造血细胞粘附 分子CD9d和CD9e及其基质细胞上血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的表达及川芎嗪 对其表达的影响 , 进一步探讨促进再障骨髓恢复造血的机制和治疗方法。材料和方法1实验动物 近交系BALB/C小鼠(H-2d,MLe)，雌性,810周龄,体重1720 g, 由武汉生物制品研究所提供。DBA/2小鼠(H-2d,MLS),8周龄，雌雄兼用，由中山 医科大学实验动物中心提供。2 药物 磷酸川芎嗪注射液每毫升含川芎嗪 25 mg, 由

8、丽珠集团利民制药厂生 产(批号 971002)。3 试剂和仪器 大鼠抗小鼠CD9d(VLA),CD49e(VLA5),CD106(VCAM-1)单克隆抗体和 羊抗大鼠免疫球蛋白 FITC 结合抗体购自 PharMigen 公司, 流式细胞仪为 BeCton DiCkinson 公司产品 , SABC(Strept Avidin-Biotin-enzyme Complex) 购自 Boster公司，氢化可的松购自Sigma公司。4分组及处理 BALB/C小鼠27只,随机平均分为3组。川芎嗪组：按姚军等方 法'2'制备再障小鼠模型后即腹腔注射川芎嗪注射液,每只5 mg,每天2次,连

9、续 13天; 再障组： 按以上方法制模后即腹腔注射生理盐水 , 每只 0.2 ml, 用法如上 ; 正常组： 未作任何处理。第 14天称体重后观察下述指标。5骨髓有核细胞(BMNC计数 参照文献3方法。6骨髓单个核细胞(MNC粘附分子CD9d、CD9e表达的检测 调骨髓MN(浓度为 1X 107ml,按左连富介绍的方法'4,用流式细胞仪检测CD9d、CD9e表达水平。7骨髓基质细胞VCAM-1表达水平的测定骨髓基质细胞培养体系制备与文献5相同。第28天基质形成，吸去培养板中培养液，用PBS液轻轻洗3次，力卩 入丙酮4 C固定10分钟，晾干，粘于载玻片上。免疫组织化学以 SABC方法进

10、行DAB显色。结果判断：细胞膜显棕色为阳性，随机计数5个高倍镜(X 40)视野 中阳性细胞百分率。8 统计学分析 数据以 <"x- (851 bytes)"src="/med/cano/201003/20100317181543447" 13 15> ±s 表示，采用 t 检验。结果表 1 显示 , 再障组小鼠白细胞计数 , 骨髓有核细胞计数均显著低于正常。 再 障组骨髓MNCt CDbd、CD9e表达水平明显低于正常组(t=11.96和17.18,P均 <0.001)。川芎嗪组骨髓MNCt CD9d、CD9e表达水平显著高于

11、再障组(t=9.05和 14.61,P均<0.001),其中CD9e的表达已达正常。川芎嗪组基质细胞表达 VCAM-1 的阳性率已近正常 , 且显著高于再障组 (t=6.91,P<0.001) 。川芎嗪组与正常组一 样, 基质细胞生长浓密 , 以梭形成纤维细胞为主 ;再障组基质细胞凋零稀疏 , 多为 圆形细胞 , 成纤维细胞的伪足不明显。表1川芎嗪对免疫再障小鼠骨髓单个核细胞CE49d> CD9e及基质细胞VCAM-1表达的影响(<"x- (851 bytes)" src="/med/cano/201003/2010031718154344

12、7"13 15> ± s)组别鼠1WBC(X 109/L)骨髓MNCC(X1骨；根股(荧光强度)CDoe(荧光强度)VCAM-1(%)正常组96.4 ± 0.812.8 ± 1.756.55 ± 5.1454.42 ± 0. 9561.4 ± 12.1再障组9A1.5 ± 0.72.7 ± 0.6 34.50 ± 2.04 A35.27 ± 2.4828.1 ± 7.2 川芎嗪 组92.9 ± 0.7 *6.2 ± 0.4 *47.38 ±

13、 3.75 *56.19 ± 2.99*56.7 ± 10.1 *注：与正常组比较P<0.001; *与再障组比较P<0.001基质细胞与造血细胞的直接连接有传递转换信息分子的作用，此种连接是通 过基质细胞与造血细胞表面的粘附分子实现的,细胞粘附分子VLA(VeryLate antigen)是红系祖细胞的纤维连接蛋白(Fn)的受体，VLA 4是髓系造血祖细 胞的Fn及VCAM-1的受体。90%以上的CD；细胞，包括红系爆式集落(BFU-E)和 粒-巨噬系集落(CFU-GM都表达VLA和VLA。VCAM-俵达于骨髓微环境网状 纤维细胞和骨髓微血管内皮细胞上。VCA

14、M-1在调节造血中有重要作用，参与造 血细胞与基质细胞形成聚集体7,有利于造血细胞增殖、分化。本研究结果显 示再障小鼠骨髓造血细胞粘附分子受体 VLA、VLA显著低于正常小鼠，再障小鼠 骨髓基质细胞上VLA的配体VCAM-1也显著低于正常小鼠。因此，如能增强 VLA、VLA及VCAM-1的表达，将有助于骨髓造血细胞与基质细胞及细胞外基质 的粘附,促进造血干细胞的增生。我们曾观察到川芎嗪通过促进骨髓微血管的修复，增加骨髓供氧，促进基质 细胞生长及其粘附功能，改善骨髓微环境，增加免疫介导再障小鼠骨髓细胞 CD4 抗原表达宙8。本研究结果进一步表明川芎嗪显著增强再障小鼠骨髓造血细胞 VLA、VLA的

15、表达，同时增加基质细胞VCAM-1的表达,说明川芎嗪不仅作用于基 质细胞,提高粘附分子配体表达，同时作用于造血细胞，提高其粘附分子受体的表 达,从而加强基质细胞与造血细胞相互作用，促进骨髓造血细胞的增生。本课题受国家自然科学基金(39670911)和湖北省自然科学基金(96J080)资助 作者单位：董凌莉 刘文励孙汉英徐慧珍 430030武汉，同济医科大学 附属同济医院内科；陶德定同济医科大学附属同济医院分子生物学研究室参考文献1 Clulombel L, Auffray I, Gaugler MH, et al. Exp ressi on and function of in tegri n

16、s on hemat opo ietic p roge nitor cells. Acta Haematol,1997,97:13-21.2 姚军, 李树浓.淋巴细胞与再生障碍性贫血的实验研究 . 中华血液学杂志， 1991,12:229-231.3 唐佩弦, 杨天楹,主编. 造血细胞培养技术 . 西安：陕西科学技术出版社 , 1985.59-62,147-160.4 左连富 . 流式细胞术样品制备技术 . 第 1 版 . 北京: 华夏出版 社,1991.83,94-95.5 孙汉英 , 舒砚君 , 刘文励 , 等 . 川芎嗪改善免疫诱导再生障碍性贫血小鼠骨髓 微环境作用的研究 . 中华血液学杂志 , 1998,19:178-180.6 Weber MC, Tykocinski ML. Bone marrow stromal cell blockade of human leukemic cell differentiation. Blood, 1994,83:2221-2229.7 Oostendorp RA, Reisbach G, Spitzer E, et al.