免疫荧光双染

1、免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法（double immu nofluoresce neelabeli ng method） 也分为直接法和间接法。服务说明冰冻切片荧光tunel +免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3 次,每次5min。2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶 K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织, 37度温箱孵育30min。将玻片置于 PB

2、S（ PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗 涤3次，每次5min。3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（ PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min4、 加试剂1,2 :按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 （TdT）和试剂2（dUTP）按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37C恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。5、 BSA封闭:将玻片置于PBS（ PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3次， 每次 5min ，在圈内滴加 用 3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭 30min。6

3、、加一抗： 轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加 PBS 按一定比例配好的一抗， 切片平放于湿盒内4 °孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、 加二抗：玻片置于PBS（ PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3次，每次 5min 。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的 二抗 覆盖组织， 避光室温 孵育 50min 。8 DAPI复染细胞核：切片用PBS（ PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS 后在圈内滴加 DAPI 染液，避光室温孵育 10min。9、封片： 玻片置于 PBS （PH7.4） 中在脱色摇床上晃动洗涤 3次，每次5min 。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。1

4、0、镜检拍照： 切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。 （紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm; FITC绿光激发波长465-495nm， 发射波长 515-555 nm； CY3 红光激发波长 510-560，发射波长 590nm）石蜡切片 荧光tunel+免疫荧光双标 实验步骤1、 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯 I 15-20mi n-二甲苯n 15- 20min-无水乙醇I 10min-无水乙醇n 10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。2、修复： 切片稍甩干后用组化笔在组织

5、周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶 K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织,37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。3、破膜： 切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。4、 加试剂 1,2：按片子数量和组织大小取tunel 试剂盒内适量试剂1 (TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿 盒内，37C恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。5、 BSA封闭:将玻片置于PBS

6、 ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温圭寸闭30min。6、 加一抗： 轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS 按一定比例配好的一抗， 切片平放于湿盒内 4°C 孵育过夜。 (湿盒内加少量水防止抗体蒸发)7、 加二抗：玻片置于PBS ( PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤 3次，每 次 5min 。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的 二抗 覆盖组织， 避光室温 孵育 50min。8 DAPI复染细胞核： 切片用PBS ( PH7.4)洗涤3次，每次5min。去除 PBS后在圈内滴加 DAPI染液，避光室温孵育10min。9、封片： 玻片置于 PBS(PH7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。10、镜检拍照： 切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。(紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm; FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长 515-555 nm； CY3 红光激发波长 510-560，发射波长 590nm)注意事项1荧光染色后一般在1