应用自旋标记—顺磁共振研究严重烧伤大鼠早期心肌细胞膜变化

1、应用自旋标记顺磁共振研究严重烧伤大鼠早期心肌细胞膜变化【摘要】目的利用自旋标记顺磁共振技术研究严重烧伤大鼠早期心肌细胞膜的变化。方法用5-氮氧自由基硬脂酸(5-doxylstearic acid,5NS)和16-氮氧自由基硬酯酸(16-doxylstearic acid,16NS)分别掺入到不同深度的膜类脂区，观察严重烧伤对大鼠心肌细胞不同深度的膜类脂区流动性的影响，同时用3-甲基马来酰亚胺氮氧自由基(3-maleidoproxy1,3MP)标记膜蛋白巯基，观察膜蛋白旋转相关时间(c)及强固定化与弱固定化组分谱线高度比值(hs/hw)的变化。结果严重烧伤大鼠早期心肌细胞膜脂浅层的序参数(S)值

2、无明显变化，而膜脂深层S值增大，膜蛋白hs/hw显著增大，膜蛋白旋转相关时间c也显著增大。结论严重烧伤后早期即出现心肌细胞膜的损伤，表现为膜脂质深层流动性下降，膜蛋白构象改变，膜蛋白运动受限。这些变化可以直接影响细胞膜蛋白的功能，从而导致心肌细胞功能的变化。【关键词】烧伤心肌细胞细胞膜顺磁共振自旋标记 Early cardiac myocyte membrane changes in severely burned rats:a spin labding-ESR studyTANG Hongtai, CHEN Yulin, SHEN Hongxin, et al.Department of B

3、urns,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai,200433.【Abstract】ObjectiveTo demonstrate the mechanism of early cardiac myocyte membrane damage at molecular level in severely burned rats.MethodsSD rats were randomly divided into sham-burn and burn groups.A 30% TBSA burn was create

4、d in burn group.Hearts were obtained at different time post-burn.Cardiac myocytes isolated by collagenase using Langendoff perfusion apparatus were spin labeled with 5-doxylstearic acid (5NS),16-doxylstearic acid (16NS) and 3-maleidoproxy1(3MP).The order parameters (S value),hs/hw ratio and rotation

5、al correlation time (c) were measured according to the spin labeling-ESR spectra.ResultsThe S value of the polar head-group region of membrane lipid,as reported by 5NS,did not changed signicantly,while that of the lipid in the hydrophobic midzone,as reported by 16NS,increased signicantly.The hs/hw r

6、atio of 2 and 6 hours postburn groups increased significantly postburn compared with that of the sham-burn group,and so did the rotational correlation time in 1 to 12h post-burn groups.ConclusionThere were structural and functional changes in cardiac myocyte membrane after burn injury.They were char

7、acterized by decreased fluidity in the deeper part of membrane lipid,configurational changes and motion restriction in membrane proteins.They could affect the normal performance of cardiac function.【Key words】Burns Cardiac myocyte Membrane ESR Spin labeling细胞正常的功能和代谢有赖于细胞膜结构和功能的完整。休克时细胞膜功能障碍出现最早。大量的

8、研究表明严重烧伤早期就有心肌细胞膜结构和功能的变化，表现为细胞膜通透性增强、ATP酶活性降低和细胞膜组分变化等。我们拟用自旋标记顺磁共振技术研究严重烧伤后早期心肌细胞膜流动性、膜蛋白构象及运动的变化，以探讨严重烧伤后心脏损伤的机制。1材料和方法1.1实验动物和模型制作SD大鼠，体重200250g，雌雄不拘，上海计划生育研究所提供。实验前禁水食12h。以30mg/kg的戊巴比妥钠行腹腔麻醉，背部剃毛后，随机分组。烧伤组动物背部浸入100水中10秒，造成30%体表面积的度烧伤。对照组动物以38水假伤。伤后动物自由进水食。1.2试验和仪器5-氮氧自由基硬脂酸(5-doxylstearic acid,

9、5NS)、16-氮氧自由基硬脂酸(16-doxylstearic acid,16NS)、3-甲基马来酰亚胺氮氧自由基(3-maleido-proxy1,3MP)和型胶原酶等(美国Sigma公司)，ER 200D-SRC电子顺磁共振仪(德国Bruker公司)，Langendorff灌流装置(上海玻璃仪器一厂)。1.3动物分组48只动物随机分成正常对照组，烧伤后0.5，1，2，6和12h组，各组动物数均为8。于上述时相点行开胸术，取出心脏，用于心肌细胞分离。1.4心肌细胞分离1腹腔注射肝素钠1 000U/kg，30min后用1%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉，行开胸术迅速取出心脏，置于冰冷(

10、04)的5%CO2和95%O2混合气饱和的无钙KH液(以mmol/L为单位：NaCl 118、NaHCO3 25、KCl 4.7、KH2PO4 1.2、MgSO4 1.2、Glucose 10)中，行主动脉插管，注入无钙KH液10ml，洗净血液，继用改良的Langendorff灌流装置，逆行循环灌流心脏(3ml/min)。5min后用混合气饱和的消化液(含胶原酶0.5mg/ml、牛血清白蛋白1mg/ml和CaCl2 40mmol/L)灌流30min，取下心脏置于混合气饱和的改良KB液(以mmol/L为单位：KCl 75、MgSO4 5、Taurine 20、Na2-ATP2、Glucose 1

11、0、EGTA 0.5、Hepes 10，用KOH调pH值至7.4)中37孵育15min，在KB液中将心肌剪成约1mm3大小碎片，用吸管反复吹打，以分离心肌细胞。用200目滤网过滤，滤液静置沉淀10min，弃去上清液。用新配制的DMEM细胞培养液稀释细胞，使其浓度为2.5105个/ml。在显微镜下观察约80%以上的心肌细胞呈细长杆状，纹理清晰，对台盼蓝呈排斥反应。1.5自旋标记2，3将一定量的自旋标记物(5NS，16NS和3MP)分别用无水乙醇溶解后，取适量置于Eppendorf管中，通氮气干燥，使其铺成薄层，加入细胞悬液(浓度为2.5105个/ml)1 ml，使各种标记物的最终浓度为0.1mm

12、ol，振荡均匀后置于37孵箱孵育。5NS和16NS标记的样品孵化30min，3MP标记的样品孵化3h(其间多次振荡均匀样品)。测定前用DMEM培养基洗涤4次(每次5 000r/min，离心3min)，至上清液检测不出游离ESR信号为止，弃上清液，沉淀封入石英毛细管进行测量。将两种标记物5NS和16NS标记到心肌细胞膜上后，标记物就与膜磷脂分子密切结合，其极性基团朝向膜双分子脂层的表面。根据结合于脂肪酸链上的氮氧自由基的位置的不同，从其ESR波谱可得到心肌细胞膜不同深度层次的信息。5NS上的自由基接近于表层，而16NS上的自由基接近于深层。而3MP可与膜蛋白的巯基结合，通过ESR波谱研究可以反映

13、膜蛋白构象和运动的变化。1.6ESR波谱测定使用德国Bruker-ER 200D型电子自旋共振波谱仪，X波段进行测量。微波功率20.0mW，室温下测定，调制1.02.0高斯(G)，扫宽100G，中心磁场3485G。1.7波谱分析根据5NS和16NS标记的样品所测得的ESR波谱分别计算各自的序参数S4，以观察细胞膜的流动性。S=0.568(T-T）/aa=(T+2T)/3式中T和2T分别为外、内端超精细劈裂(G)3-甲基马来酰亚胺氮氧自由基标记的样品所测得的典型ESR波谱含强固定化成分和弱固定化成分，测得峰高hs和hw，计算hs/hw的比值，可直接反应膜蛋白构象的变化。膜蛋白的旋转相关时间c反映

14、蛋白分子由一种构象旋转到另一种构象所需的时间，以反应膜蛋白分子运动的快慢，可用下列公式计算5，6：c=3.41810-10H0H(0)/h(-1)1/2-h(0)/h(1)1/2式中H0为中场线宽度(G)，h(1),h(0)和h(-1)分别为量子选择跃迁M为1，0和-1时的谱线高度。1.8统计学处理测定结果以均数标准差表示，采用t检验。2结果2.1膜脂流动性的变化表1可见5NS标记的严重烧伤早期心肌细胞膜脂的序参数无明显变化，说明心肌细胞膜浅层膜脂的流动性无明显变化；16NS标记的心肌细胞膜脂的序参数在伤后各时相点均显著增加，说明严重烧伤后心肌细胞深层膜脂的流动性显著降低。表15NS和16NS

15、标记的心肌细胞膜脂序参数S的变化Tab 1Changes of order parameter in cardiac myocyte spin-labeled with 5NS and 16NS样品对照组伤后时间(h)0.5126125NS0.6930.0210.6960.0190.7020.0220.7060.0310.6910.0250.6900.01916NS0.1780.0170.1970.011*0.2060.013*0.2120.015*0.2180.012*0.2080.013*n=8，与对照组比较：*P0.05,*P0.012.2膜蛋白构象及运动的变化从表2可以看出，严重烧伤后

16、hs/hw和c显著增大，前者提示严重烧伤后膜蛋白强固定化成分相对比例增大，也可以说是表示膜表面自由度较大的弱固定化组分所占的相对比例减少，但都说明严重烧伤后心肌细胞膜蛋白的构象发生了变化；后者说明膜蛋白由一种构象转变到另一种构象的时间变长，膜蛋白的运动速度减慢。表23MP标记的心肌细胞膜蛋白hs/hw和c的变化Tab 2Changes of hs/hw and c in cardiac myocyte spin-labeled with 3MP测定指标对照组伤后时间(h)0.512612hs/hw0.2060.0270.210.0150.2240.0170.2350.015*0.2440.01

17、4*0.2220.015c(10-10s)12.310.79712.720.75013.370.943*13.950.991*14.340.937*13.850.819*n=8，与对照组比较：*P0.05,*P0.013讨论细胞膜是细胞功能的重要调节器，它不仅有屏障作用，可以防止细胞内物质流失，维持细胞的一定形态，还有许多重要的生理功能。凡物质运输、能量转换、信息传递、细胞表面识别、细胞运动、细胞分化等功能无不与细胞膜有关。众多研究表明，细胞膜变化是细胞损伤的早期表现之一，细胞膜结构和功能的变化，直接影响着细胞正常功能的发挥7。细胞膜由膜蛋白、脂质和糖组成。膜脂主要包括磷脂、脂多糖和胆固醇。细

18、胞膜的流动性是重要的生物物理特征并与膜功能或细胞功能的调节密切相关。膜流动性是反映细胞功能的一种重要而敏感的指标，许多疾病在病理发展过程中都表现出细胞膜流动性的变化。有许多因素影响细胞膜的流动性，如磷脂成分的变化、磷脂所含脂肪酸的不同、膜脂中胆固醇含量的变化、离子强度和阳离子浓度的变化以及膜蛋白含量的变化等等。我们的研究结果表明严重烧伤大鼠早期心肌细胞膜深层膜脂流动性下降，其原因可能是多方面的。其一，严重烧伤后心肌细胞膜磷脂含量发生了变化。郇京宁等8报道了严重烧伤大鼠早期心肌组织总磷脂含量明显降低，伤后6h为对照组的64.5%，磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺含量减少，至伤后12h尚未恢复到对照组水平

19、。膜磷脂含量的变化直接影响细胞膜的流动性；其二，氧自由基的损伤9，10。烧伤后组织内可产生大量的氧自由基，发生膜脂质过氧化反应，使细胞膜内多价不饱和脂肪酸减少，从而使细胞膜的流动性降低；其三，严重烧伤后磷脂酶A2活性的升高，磷脂酶A2可水解心肌细胞膜，导致膜流动性下降8，11。至于浅层和深层膜脂的流动性变化差异的原因尚需进一步研究。虽然脂质可以形成膜结构，但许多膜功能及代谢仍依赖膜蛋白来完成。膜蛋白和膜脂之间相互作用相互影响，构成完整的功能复合物。膜蛋白周围的脂质称为界面脂，不少有活性的蛋白质(特别是酶)需要有界面脂才表现活性，如界面脂组分有变化或界面脂邻近的脂质流动性改变(或兼而有之)，都会

20、影响其活性。不难看出细胞膜脂质流动性下降的直接后果是影响膜蛋白运动和构象变化，从而影响膜蛋白功能的发挥。本实验应用3-甲基马来酰亚胺氮氧自由基标记的膜蛋白来观察其构象和运动的变化。3MP可与膜蛋白的巯基专一性结合。hs/hw的比值可直接反映膜蛋白构象的变化。膜蛋白的旋转相关时间c反映的是膜蛋白分子运动的快慢。结果表明严重烧伤后hs/hw和c显著增大，提示严重烧伤后膜蛋白强固定化成分相对增多，膜蛋白的构象发生了变化，同时膜蛋白的运动速度减慢。严重烧伤后心肌细胞膜蛋白构象和运动变化的原因是多方面的。如上所述的细胞膜流动性的变化是其中之一，而烧伤后氧自由基的作用不可忽视。烧伤后体内产生的氧自由基，不

21、仅可以作用于膜脂，使膜脂发生脂质过氧化反应，而且可以作用于膜蛋白，使膜蛋白发生交联变性反应，从而改变膜蛋白的构象，影响膜蛋白的运动12，13。已有研究表明，严重烧伤后心肌细胞膜ATPase的活性明显下降14，本研究至少可以部分解释其中的机制。首先严重烧伤后心肌细胞膜蛋白的构象和运动发生了变化，而这些变化可以直接影响膜蛋白的活性；其次，细胞膜脂的流动性下降可以影响酶蛋白的活性15。本课题受国家自然科学基金资助作者单位：唐洪泰陈玉林沈洪兴李元义白刚葛绳德夏照帆上海，第二军医大学长海医院烧伤科200433陈士明严小敏复旦大学分析测试中心参考文献1Linseman DA,Wall TM,Hartman

22、 JC,et al.The trolox analog U8517F attenuates hypoxic injury in isolated cardiac myocytes.J Mol Cell Cardiol,1994,26:1249-1257.2Cobb CE,Juliao S,Balasubramanian K,et al.Effects of diethyl ether on membrane lipid ordering and on rotational dynamics of the anion exchange protein in intact human erythr

23、ocytes:Correlations with anion exchange function.Biochemistry,1990,29:10799-10806.3吴泽志，陈槐卿，薛振南，等.用马来酰亚胺自旋标记研究库存血红细胞膜蛋白质构象.生物物理学报，1992，8：731-734.4杨福愉，郭倍奇，王大辉，等.膜蛋白嵌入脂质体的研究.中国科学B辑，1983，6：519-527.5赵保路，张清刚，张建中，等.用脂肪酸自旋标记研究中国地鼠肺正常细胞V79和癌变细胞V79-B1膜的流动性.科学通报，1982，27：686-689.6程龙生，唐祥，郑建华.竹红菌甲素对人红细胞膜光损伤的ESR研究.生物化学与生物物理学报，1988，20：155-159.7金惠铭.微循环与休克.上海：上海医科大学出版社，1993:30-40.8郇京宁，陈玉林，葛绳德.烧伤对大鼠心肌组织磷脂含量的影响. 第二军医大学学报，1996，17(增刊)：28-30.9程时.生物膜与疾病.北