雌二醇的免疫胶体金试纸法检测(1)

1、雌二醇的免疫胶体金试纸法检测(1)    【关键词】 雌二醇雌二醇(17-Estradiol)是天然雌激素的重要成分，为防止儿童性早熟等问题，食品中尤其是畜禽产品的雌二醇检测不容忽视。胶体金免疫层析技术(GICA)在检测小分子有机物方面越来越受到重视。其基本原理是胶体金颗粒能够稳定吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性无明显变化，所以它可以取代酶标记抗体1，2。本实验采用标记有雌二醇单克隆抗体的胶体金颗粒与相对应的固定在硝酸纤维膜上的雌二醇结合物相结合，固定有雌二醇结合物的检测线处就显现明显的颜色3，4。本法具有灵敏度高、特异性强、简便快速、成本较低、结果容易判

2、读等优点，适用于样品的初步筛选。1 材料与方法11 试剂与仪器 氯金酸(上海化学试剂厂)；牛血清白蛋白、卵清白蛋白、兔抗鼠多抗(天津联星生物公司)；雌二醇标准品、雌二醇单抗、17-Estradiol-6-one6-(o-carboxymethvyoxime)美国Sigma公司)；其他试剂均为国产分析纯。硝酸纤维膜、玻璃纤维膜（美国Millipore公司)；Beckman Du530分光光度计(德国Beckman公司)；低温高速离心机(军事医学科学院）；点膜机(美国Bio-Dot公司)。12 方法121 胶体金的制备 用三蒸水溶解氯金酸，使其终浓度为01gL。先进行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸后，每

3、100ml加入1柠檬酸三钠25ml，再沸水浴下快速搅拌，直到氯金酸溶液的颜色稳定，继续沸水浴10min5，冷却至室温后，用透射电镜镜检并用分光光度计检测颗粒均匀度及粒度。最后置于4冰箱保存备用。122 最适标记蛋白量的确定 用02molL K2CO3将胶体金溶液调至pH为82，然后取试管9支，分别加入10ml胶体金溶液。将雌二醇抗体逐级稀释后，各取等体积稀释液顺序加入上述试管中，混匀，另设一不加抗体的对照管。放置10min，在各管中加入01ml的10NaCl，混匀后静置2h。观察各管中胶体金溶液变化，未加蛋白及加入量不足的溶液颜色由红变蓝，而加入蛋白量达到或超过时的溶液则保持不变。标记蛋白量即

4、为最低稳定胶体金溶液不变色的蛋白量基础上再加20。123 胶体金探针的标记 将抗体用0005mol NaCl溶液透析过夜，离心除去蛋白沉淀，调至05mgml。取胶体金100ml，用0，2molL K2CO3将胶体金溶液调至pH为90，磁力快速搅拌下缓慢加入24ml稀释的雌二醇抗体，继续搅拌10min，加入牛血清白蛋白(BSA)，使其最终浓度为1，再搅拌10min。将初步制得的胶体金探针以4000rmm离心20min；弃沉淀，上清以10000rmin离心60min；弃上清，沉淀用001molL的磷酸盐缓冲液(PBS)(含1牛血清白蛋白)重新悬浮；同前离心洗涤2次，将沉淀用001molL的PBS(

5、pH82，含1BSA，002NaN3)悬浮，4保存备用。124 抗原的合成 小分子物质难以固定在硝酸纤维膜上，只有使它连上大分子物质才能较好地固定。本实验采用混合酸酐法制备完全抗原。雌二醇-6-肟43mg,加入三正丁胺50l,二氧六环4ml，冰浴冷却到10以下，加入氯甲酸乙酯15l6。410下反应30min。配制卵清白蛋白(OVA)溶液(OVA 10mg，3ml水，3ml二氧六环，1molL氢氧化钠03ml)。将配制好的OVA溶液加入反应液，4冰浴搅拌6h，反应过程中，用氢氧化钠维持pH值为8。反应完毕后，将反应液加入透析袋，透析2d。将透析液调至pH45，冰箱4，放置4天，有黄色沉淀出现。离

6、心收集沉淀，冷冻干燥，4冰箱保存。将OVA溶于透析液内作为参比，用紫外光谱法对雌二醇-6肟-OVA进行定性检验。经紫外测定证明蛋白质已与雌二醇衍生物结合。125 胶体金免疫层析试纸条制备 测试条由玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、加样纸、吸水纸4部分组成。将玻璃纤维膜裁成6mm的细条，然后放入含1BSA、1Tween-20的PB液中浸泡30min，37烘干，最后将胶体金探针灌注已处理好的玻璃纤维膜上，真空干燥备用。在硝酸纤维膜上用点膜机将上述抗原和兔抗鼠IgG喷成2条线，分别为检测线和对照线，经真空干燥后，用1BSA、001molL PBS（pH90)封闭2h，以001molL PBS洗涤，再真空干燥。

7、将30mm吸水纸、25mm硝酸纤维膜、6mm玻璃纤维膜、15mm加样纸，由顶部依次粘于PVC板上，裁成细条备用。126 检测与判读 样品：含已知浓度雌二醇样品的乙醇溶液分为3组，第1组不加雌二醇，第2组为02gml雌二醇，第3组为04gml雌二醇。将加样纸一端插入待测液，湿润后取出，水平放置，约35min，观察结果。如试纸条硝酸纤维膜上仅对照线呈一条紫红色带为阳性；如出现2条紫红色带为阴性；如质控线不出现紫红色带，无论检测线是否出现，测试结果均无效。2 结果与分析21 胶体金颗粒大小选择 胶体金颗粒吸附蛋白并显示检测结果，其大小是重要影响因素之一。胶体金颗粒的大小，由制备胶体金时加入的柠檬酸三

8、钠量决定，当柠檬酸三钠加入越多，胶体金颗粒也越多，但颗粒直径越小，反之胶体金颗粒越大。胶体金颗粒小，结合蛋白量少，反应结合率低，另外难以显示明亮清晰的颜色，影响显色效果；胶体金颗粒大，其结合蛋白后不稳定，不易保存，另外其结合蛋白后难以通过膜7。本实验选用的胶体金颗粒直径约为15min，既可以通过膜，反应彻底，又易保存，反应结果显色清晰。22 胶体金颗粒鉴定 胶体金颗粒大小及均一程度是检测结果可靠的基础，制备完毕后须经质量鉴定才能应用。用Beckman Du530分光光度计对胶体金进行扫描，发现其主峰宽度较小，表明制备的胶体金颗粒较均匀，max为520nm(图1)，表明其粒度约为15nm8。用电镜观测结果(图2)与分光光度计测定结果一致。电镜观测是鉴定胶体金颗粒粒径及分布的标准，但这种方法不便用于日常工作使用，而用分光光度计测定操作简便，更适合实验室日常使用。图1 胶体金的可见光谱图（略）23 最适蛋白量 阴性对照为未加抗体管，17管抗体浓度分别为10,12,14,16,18,20,22gml,阳性对照为胶体金溶液。可见，本实验最适标记蛋白量为20gml(图