钙拮抗剂对大鼠心肌缺血再灌注早期生长反应基因-1表达的影响

1、钙拮抗剂对大鼠心肌缺血再灌注早期生长反应基因-1表达的影响         08-11-29 14:15:00     编辑：studa20                    作者：李海青，石刚刚，高分飞，贾强用【摘要】  目的：研究钙拮抗剂(维拉帕米、地尔硫芭卓和硝苯地平)

2、对大鼠心肌缺血再灌注(I/R)芭卓早期生长反应基因-1(Egr-1)表达的影响。方法：大鼠随机分为假手术组、I/R组、二甲基亚砜组、维拉帕米组、地尔硫芭卓组、硝苯地平组。Western blot法测定Egr-1蛋白表达水平的变化；RT-PCR法测定Egr-1 mRNA表达水平的变化。结果：与假手术组比，I/R组Egr-1蛋白及Egr-1 mRNA表达显著增高(P<0.05)；与I/R组比，维拉帕米组、地尔硫芭卓组和硝苯地平组Egr-1蛋白及Egr-1 mRNA表达明显减少(P<0.05)。结论：维拉帕米、地尔硫芭卓和硝苯地平均可抑制缺血再灌注心肌Egr-1蛋白及Egr-1 mRNA

3、的过度表达。 【关键词】  钙拮抗剂；缺血再灌注；早期生长反应基因-1AbstractObjective: To study the effects of calcium antagonist(verapamil、diltiazem and nifedipine)on early growth response gene-1(Egr-1)expression in rats after myocardial ischemia-reperfusion(I/R). Methods: Rats were randomly assigned into Sham、I/R、DMSO、verapa

4、mil、diltiazem、nifedipine groups. The expression levels of Egr-1 protein and mRNA were examined by Western blot and RT-PCR, respectively. Results: Compared with sham group, Egr-1 protein and mRNA of I/R group overexpressed(P<0.05). The expression levels of Egr-1 of verapamil、diltiazem、nifedipine g

5、roups significantly decreased, compared with I/R group(P<0.05). Conclusion: Verapamil、diltiazem and nifedipine can inhibit the overexpression of Egr-1 protein and mRNA in  rats caused by I/R.Key Wordscalcium atagonist; ischemia-reperfusion; early growth response gene-1    细胞内钙

6、超载是缺血再灌注(I/R)损伤的主要病理机制之一，而作为构成I/R损伤分子通路共同分子基础的核内转录因子Egr-11，其与细胞内Ca2+之间存在非常紧密的联系，Ca2+可通过不同的信号转导途径直接或间接影响Egr-1的表达。众所周知，钙拮抗剂防治心肌I/R损伤的主要机制是阻断心肌细胞膜钙通道，降低细胞内钙离子浓度(Ca2+)i，拮抗钙超载。而我们的前期工作也证实了F2和维拉帕米均能通过阻断心肌细胞膜钙通道，降低心肌细胞(Ca2+)i，防止钙超载拮抗心肌I/R Egr-1的异常表达2,3。因此我们提出假设：具有钙拮抗作用的化合物均有抑制Egr-1高表达的效应。为了验证这一假设，进一步探讨钙拮抗剂

7、的共性作用，本实验通过建立大鼠心肌I/R损伤模型，运用3种经典的钙拮抗剂，观察其对Egr-1 mRNA及Egr-1蛋白表达的影响，为进一步探讨其分子生物学机制提供有力的依据。1  材料与方法1.1  动物    SD大鼠广州第一军医大学动物中心提供许可证号：SCXK(粤)2006-0015,2006B008；SPF雌雄不拘，体质量250350g。1.2  仪器与试剂    BL-420E信号记录分析系统(四川成都泰盟科技有限公司，中国)；低温高速离心机(Eppendorf公司，德国)；乳化分析仪(IKA公

8、司，德国)；聚丙烯酰胺凝胶电泳相关仪器、凝胶成像分析系统、转印系统、紫外分光光度计、全自动PCR扩增仪(Bio-RAD公司，美国)；压力蒸汽灭菌器(嘉兴市中新医疗仪器有限公司，中国)；电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂，中国)；二甲基亚砜(DMSO，上海凌峰化学试剂有限公司，中国)；兔抗大鼠Egr-1多克隆抗体(Santa Crutz公司，美国)；HRP标记的山羊抗兔IgG、小鼠抗大鼠-actin单克隆抗体、HRP标记2抗IgG(博士德公司,中国)；硝酸纤维素膜、Trizol试剂、PCR扩增反应试剂盒(Invitrogen公司,美国)；Egr-1引物和-actin引物(上海华美生物工程公司

9、，中国)；第一链cDNA合成试剂盒(MBI Fermentas公司,立陶宛)；维拉帕米(恒瑞医药股份有限公司，中国)；硝苯地平和地尔硫芭卓(Sigma公司，美国)。1.3  心肌I/R模型的建立及分组    大鼠称重,乌拉坦(1.0g/kg)腹腔麻醉，分离气管后立即行正压人工呼吸(频率60次/min，流量2mL/100g)。从左侧第3、4肋间打开胸腔，暴露心脏，剪破心包膜，用2个小拉钩撑开并向下按压胸廓使心脏暴露于胸腔外，在肺动脉圆锥左缘平左心耳下缘2mm冠状动脉处进针，用5/0丝线穿过心肌层。结扎冠状动脉时连同直径2mm的塑料胶管一起结扎造成心肌缺血6

10、0min，然后解除结扎再灌注180min。    大鼠随机分为I/R组(术前5min予NS 1mL/kg，结扎大鼠冠状动脉前降支，60min后松开结扎线，恢复血流，再灌注180min)；DMSO组(术前5min改NS为DMSO，手术操作同I/R组)；维拉帕米组(术前5min予维拉帕米0.5mg/kg,用NS稀释，同样按照1mL/kg给予)；地尔硫芭卓组(术前5min予地尔硫芭卓0.8mg/kg,用NS稀释成1mL/kg给予)；硝苯地平组(术前5min予硝苯地平0.2mg/kg，用NS稀释成1mL/kg给予)；假手术组(术前5min予NS 1mL/kg，手术时冠状动

11、脉前降支穿线但不结扎，持续观察240min)。1.4  Egr-1蛋白测定    取100mg心肌组织块，用干净的剪刀将组织于冰上快速剪碎，加入预冷的裂解液20mmol/L Tris·HCl，150mmol/L NaCl，体积分数1的TritonX-100，1mmol/L乙二胺四乙酸；pH 7.41.5mL与5L的Protease inhibitor cocktail ，用乳化分散仪将心肌组织于冰上充分匀浆，每一标本匀浆30s冰上静置30s，共匀浆3次，匀浆至无明显组织颗粒为止，冰上静置10min，2655g，离心10min(4)，弃上清液，加

12、入裂解液200L，冰上静置裂解2h， 期间不断涡旋使其充分裂解， 然后15294g，离心20min(4)，吸取部分上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，部分上清液与5×上样缓冲液41混合，煮沸5min。配制分离胶与浓缩胶，然后每一泳道加60g蛋白样品，电泳(125V，80min)，转膜(350mA，60min)。封闭液封闭1h，加入1200 Egr-1抗体稀释液，4过夜，洗膜3次，每次10min，加11500的2抗稀释液室温孵育2h，洗膜3次，每次10min，滴11 Ecl化学发光试剂于膜上，反应1min，压片1min，曝光1min，将胶片进行显影、定影。1.5  Egr-1

13、 mRNA的测定    取-30冰箱保存的100mg心肌组织块，转移到5mL离心管中，每管加入1mL Trizol试剂，用干净的剪刀将组织于冰上快速剪碎，用乳化分散仪将心肌组织于冰上充分匀浆，每一标本匀浆30s冰上静置30s，共匀浆3次，匀浆至无明显组织颗粒为止。然后转移至2mL离心管中，室温静置5min，每管加氯仿0.3mL，振摇15s，室温静置3min，10621g,离心10min(4)，吸取上层水相，移至另一新的离心管中，加预冷的等体积异丙醇，-30冰箱中静置30min，15294g,离心10min(4)，弃上清液，加体积分数75%的乙醇1mL，摇振，充分洗涤沉淀，7600g,离心5min(4)，弃上清液，超净台中干燥2min，沉淀重悬于RNase-free水中，紫外分光光度计测定RNA浓度及A260/A280比值。提取的总RNA冻存于-70冰箱。采用第一链cDNA合