母牛分支杆菌菌苗对结核病小鼠Th1Th2细胞动力学及诱导型一

1、    母牛分支杆菌菌苗对结核病小鼠Th1/Th2 细胞动力学及诱导型一氧化氮合酶 表达影响的研究        摘要：目的从分子病理学角度探讨母牛分支杆菌菌苗（以下简称母牛菌苗）的免疫调节机制。方法将BALB/C小鼠随机分为3组：单纯攻毒组(A)、母牛菌苗免疫攻毒组(B)和正常对照组(N)。经尾静脉注射H37RV建立结核病小鼠模型，母牛菌苗由腹腔注射。肉眼观察肺脏病变指数并采用免疫组化染色和常规HE染色,探讨IFN-、IL-4、iNOS表达与肺脏组织损伤

2、的类型和程度的关系。结果结核病小鼠病变弥漫，伴有灶性干酪坏死，免疫组织化学染色结果显示在炎性渗出及肉芽肿内IFN-阳性细胞随时间推移逐渐增多，至第6周达高峰（0.058±0.010），与正常对照组比较有非常显著性差异（0.005±0.020，P<0.01）。此后为Tho平衡期，在肺损伤组织中IFN-和IL-4阳性细胞基本相当。iNOS表达在急性期增多慢性期减少。母牛菌苗免疫攻毒组小鼠肺组织病变，以增殖结节、淋巴样结节为主，未见坏死病变，免疫反应表现为：感染全过程中以Th1应答为主，即IFN-阳性细胞逐渐增多，第8周达高峰（0.058±0.010），IL-4阳

3、性细胞一直维持在低水平，未出现Tho平衡期。iNOS表达一直维持在高水平。结论母牛菌苗调节结核病小鼠免疫的可能机制为：启动Th1应答，抑制Th2应答，激活iNOS活性，增强机体保护性免疫。关键词：结核；母牛分支杆菌菌苗；干扰素；白细胞介素4；诱导型一氧化氮合酶Mycobacterium vaccae influences the kinetics of Th1/Th2 cells and expression of iNOS in a marine model of experimental tuberculosisZHANG Liqun(Beijing Chest Hospital, Bei

4、jing 100095, China)MA WeiluDA JipingAbstract：ObjectiveTo investigate the immunoregulative mechanism of Mycobacterium vaccae by way of molecular pathology. MethodsBALB/C mice were randomly divided into three groups: tuberculosis model (A); mice were challenged with H37RV by their tail veins and then

5、immunized by M. vaccae (B); control mice (N). Immunohistochemistry and pathological slices stained with HE were evaluated to investigate the correlation between the expression of IFN-,IL-4 and iNOS and the type and magnitude of tissue injury. ResultsA predominance of Th1 cells was observed manifeste

6、d by a high percentage of IFN- ，P<0.01). This was followed by a chronic advanced phase characterized by pneumonia local necrosis with a Tho balance due to an equivalent proportion of IFN- and IL-4 positive cells in the lung lesions. The iNOS expression was increased in acute phase and decreased i

7、n chronic phase. B group had localized lung lesions, proliferate and lymphoid nodules were predominant, there was less necrostic change. A predominance of Th1 cells was observed during the infection changed over time and there was no Tho balance phase occurred. iNOS expression had a higher level dur

8、ing the wholecourse of infection. ConclusionM.vaccae can enhance the protective immunological response by inducing Th1 response and inhibiting Th2 response.Key words：Tuberculosis；Mycobacterium vaccae；Interferon-；Interleukin-4；Inducible nitric oxide synthase随着细胞免疫学、分子生物学的进展，人们对结核病的认识发生了深刻变化。研究表明：小鼠感染

9、结核分支杆菌后产生有效的抗菌免疫需要一系列T淋巴细胞和巨噬细胞（M）的共同作用，包括T细胞抗原识别受体+及+T细胞，CD4和CD8T细胞的激活。同时，细胞因子尤其是干扰素-（IFN-）、肿瘤坏死因子-（TNF-）和白细胞介素4(IL-4）及活化M内产生的活性氮中介物等也是抗菌免疫的关键1,2。多种细胞因子的发现及其在结核病发病过程中的重要作用，为结核病免疫病理学及免疫治疗学的深入研究开辟了新路3,4，有关结核病病理和免疫学相关性的深入、系统的分子病理学研究，尚需深入进行。在治疗措施方面，由于耐多药结核病的不断增多及药物毒副作用等诸多因素，抗结核治疗面临巨大挑战，结核病的免疫治疗成为又一研究热点

10、。母牛分支杆菌菌苗（以下称母牛菌苗）是WHO在其90年代结核病研究与发展战略规划中推荐的唯一免疫治疗剂，10余年来我国学者对其进行了多方面的研究5-7，但母牛菌苗对Th1/Th2细胞动力学及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达与病理改变的相关性及对发病机制的影响尚未见报道。我们在建立小鼠结核病模型的基础上，给予母牛菌苗免疫注射，采用免疫组织化学法观察小鼠肺组织IFN-、IL-4及iNOS的定位和表达变化，旨在进一步探讨母牛菌苗的保护性免疫作用机制。材料与方法一、材料1.实验动物：BALB/C小鼠，雌雄各半，体重1820 g，购自卫生部生物制品研究所。2. 抗体：抗鼠IFN-和IL-4单克隆抗体购

11、自晶美生物工程有限公司(美国Endogen公司产)。抗iNOS多克隆抗体购自美国Santa Crus公司。3. 药品：母牛菌苗由卫生部生物制品检定所馈赠。4. 实验动物房：由北京结核病与胸部肿瘤研究所提供二级动物房。5.主要生化试剂：免疫组织化学染色采用北京中山生物技术有限公司的SP试剂盒。6.CMIAS真彩色像分析系统由解放军空军总医院提供。二、方法1. 实验动物分组：将实验动物随机分为以下3组：结核病模型组（24只，A），感染后母牛菌苗免疫组（24只，B）及正常对照组（24只，N）。2. 结核病小鼠模型的建立：取在改良罗氏培养基上生长良好的结核分支杆菌H37Rv 2周的培养物，用玛瑙乳钵磨

12、成10 mg/3 ml的均匀菌悬液（含0.05吐温80的灭菌生理盐水溶液），用生理盐水稀释成1 mg/3 ml的菌悬液，于每只小鼠尾静脉内注射0.3 ml（相当于湿菌0.1 mg/只），含菌量单位106/只。3. 母牛菌苗的给药方法：于攻毒后10天腹腔内注射母牛菌苗22.5 g只。4. 观察指标：(1) 肺部病变指数：肉眼观察各组动物肺脏结核病变范围。无病变为0；结核病变偶见为±，指数为0.5；病变范围全肺10为，指数为1；病变占全肺1024为，指数为2；病变占全肺2550为，指数为3；病变全肺50为，指数为4。(2) 光镜观察：A、B组分别于攻毒后第2、4、6、8周脱颈处死。正常小

13、鼠同期处死，每次解剖6只小鼠。取出肺脏立即放入10中性甲醛中固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋及切片，厚5 m，分别做HE染色及免疫组织化学染色。5.免疫组织化学染色方法：切片经预处理后，顺序滴加适当稀释的特异性抗体(IFN-、IL-4为1300，iNOS为1150),4过夜，生物素标记的二抗工作液，37，30分钟及辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，37，30分钟。DAB-H2O2溶液显色（110分钟）， 终止显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。结果棕黄色为阳性显色。6. 像分析：每只小鼠肺标本取3张切片进行3种抗体染色，每张切片随机选取5个视野，用像分析系统分别测定（40×5视野下）单位

14、面积 IFN-、IL-4、iNOS阳性细胞的面积，用面密度表示。7. 统计学处理：各指标以±s表示，采用方差分析和直线相关分析。结果一、小鼠肺组织病理改变感染组小鼠感染后1个月，肺组织内出现较多泡沫样的M（M吞噬结核分支杆菌后形成）及淋巴细胞形成的炎症区域，并有大量多核白细胞及蛋白渗出物。感染后2月，肺实质内广泛肺炎区伴有灶性坏死和胆固醇结晶（为M吞噬结核分支杆菌后崩解所致，1），其内有大量结核分支杆菌（抗酸染色所见）。1感染后8周小鼠肺组织病变，呈弥漫性病变，可见局灶性坏死和胆固醇结晶HE×100母牛菌苗免疫攻毒组小鼠感染后1个月，肺部病变局限化，结核性肉芽肿内出现以上皮

15、样细胞为主的增殖性结节及以淋巴细胞为主的淋巴样细胞结节。感染2个月，肺部病灶进一步局限化，结核结节更趋典型，未见灶性坏死(2)。2攻毒免疫后8周小鼠肺组织病变，可见淋巴细胞为主的淋巴细胞结节HE×100二、肺脏病变指数肉眼观察两组结核病变指数见表1。表1两组小鼠肺脏病变指数组别动物数病变指数P值单纯攻毒组24攻毒母牛菌苗组24三、IFN-和IL-4免疫细胞的动力学及组织学定位正常小鼠肺组织内可见少许IL-4、IFN-阳性细胞。感染小鼠在感染第2周IFN-阳性细胞开始增多，至第6周达高峰(3)。感染第2周IL-4阳性细胞已明显增多，至第6周达高峰。感染后4周IFN-与IL-4阳性细胞面

16、密度基本相当(4)。阳性细胞染色部位位于结核结节，肺间质、血管周围及支气管周围炎症区内，支气管上皮亦有阳性着色，M呈阳性染色。 3感染6周肺组织IFN-阳性染色明显增多免疫组化×4004感染6周肺组织IL-4阳性染色明显增多免疫组化×400组间比较，母牛菌苗免疫组IFN-阳性细胞持续增多，病程中未出现IL-4与IFN-阳性细胞相当的时期(5，6)。像结果见表2和表3。表2病程中小鼠肺内IFN-的变化（±s）组别 动物数 第2周 第4周 第6周 第8周A 24 0.058±0.010 B 24 0.049±0.020 0.057±0.0

17、30 N24 *注：与第4、6、8周比较，P0.05；与A、B组比较*P0.01 表3病程中小鼠肺内IL-4的变化（±s）组别 动物数 第2周 第4周 第6周 第8周A 24 B 24*N 24*注：与第4、6、8周比较P0.05；与A、B组比较*P0.01；与A组比较*P0.05 5 攻毒免疫8周肺组织IFN-阳性染色明显增多免疫组化×4006 攻毒免疫8周肺组织IL-4阳性染色较少免疫组化×400四、肺组织iNOS免疫组织化学染色结果正常对照小鼠支气管上皮可见少量iNOS染色阳性细胞。单纯攻毒组小鼠肺内iNOS阳性细胞在感染后2周已有增多，至4周达高峰。但随后

18、则减少，至第6周时降至最低(7)。母牛菌苗免疫攻毒组iNOS阳性细胞在感染后第2周增多，至4周达高峰，此后维持高水平(8)。像结果见表4。7感染6周肺组织iNOS阳性染色较少免疫组化×4008 攻毒免疫8周肺组织iNOS阳性染色较多免疫组化×400表4病程中小鼠肺内iNOS的变化（±s）组别 动物数 第2周 第4周 第6周 第8周A 24 0.011±0.010 0.011±0.010 B 24 *N 24*注：与第2、6、8周比较P0.05；与A、B组比较*P0.01；与A组比较*P0.05 五、IFN-、IL-4与iNOS的相关性iNOS与

19、IFN-/Il-4比值呈正相关，0.6224，P0.05。讨论许多慢性感染性疾病，包括结核分支杆菌感染，CD4细胞在宿主免疫反应中起重要作用。CD4细胞介导和调控着获得性保护性细胞免疫反应，但也参与感染的发生、慢性化及组织损伤。根据Th细胞所产生细胞因子的不同可分为Th1和Th2两种亚类细胞。Th1细胞分泌IFN-、IL-2和淋巴毒素（LT）等，主要介导细胞免疫应答，如促进细胞毒T细胞的杀伤作用，激活M杀灭细胞内病原体等。Th2细胞分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等，主要功能为促进B细胞发育和介导体液免疫应答,如促进抗体的产生、抑制Th1细胞介导的免疫应答、抑制单核-

20、巨噬细胞的激活和活性氧产物的产生等8。Tho细胞是Th1和Th2细胞的前体细胞，可以向这两种细胞转化。一般认为：Th1免疫应答能增强宿主对微生物感染,尤其是病毒与细胞内病原体的免疫性和防御功能,而Th2应答则与感染的进展、持续性和慢性化有关,对微生物感染有负性调节作用9,10。在生物体内，NO是由NO合酶（NOS）催化L-精氨酸胍基末端上氮氧化而成。NOS主要有两种类型：基础型NOS（consitive NOS ,cNOS）和诱导型NOS（induced NOS,iNOS）。研究表明，肺M中只有iNOS11，当异物入侵或肿瘤发生时，M或肿瘤细胞可以在内毒素和细胞因子作用下产生大量的NO，产生的

21、NO在宿主防御方面具有重要意义。体外实验证明，NO能介导活化M?抑制和杀伤微生物病原体12。Denis13报道用 IFN-激活小鼠M产生NO能有效地抑制其中的结核分支杆菌生长。Chan14报道活化的小鼠M产生的NO能有效杀死致病的结核分支杆菌。我们的研究结果表明：结核病小鼠肺组织IFN-IL-4比值与iNOS表达呈正相关。随着病程的进展，IFN-阳性细胞数的增多、iNOS表达亦增多，但随着IL-4阳性细胞的增多、Tho平衡期的出现，iNOS阳性细胞数反见减少。研究证实，与NO产生有关的刺激性细胞因子（IFN-，TNF-和IL-1）与抑制性细胞因子（IL-4，IL-10，TGF-）的平衡在抗分支

22、杆菌免疫中起关键作用15。我们的研究结果也支持这一观点。说明NO是M内抑制和杀伤结核分支杆菌的主要效应分子，而iNOS的活性受到Th1与Th2型细胞因子的调控。研究表明，母牛分支杆菌制剂能刺激T淋巴细胞增殖反应,加用rIL-2有明显协调作用5，能激活M产生NO7与H2O26，从而达到杀菌的目的，与卡介苗及IFN-活化M产生NO的杀菌效果一致。本研究结果表明：母牛菌苗免疫攻毒组小鼠肺部病变以增殖性结核结节和淋巴样结节为主，而渗出及坏死性病变轻；单纯攻毒组小鼠病变弥漫，出现灶性干酪性坏死。另外，实验中还观察到单纯攻毒与攻毒免疫组小鼠肺组织IFN-阳性细胞数均多，两组间无统计学差异，但前组IFN-阳

23、性细胞占优势的时间长，病程中表现为Th1应答，至少到实验结束时未出现Th0平衡期；后组在慢性期表现为Th0平衡。两组iNOS的表达也不相同。攻毒免疫组小鼠iNOS表达持续增高，病程中一直维持高水平；而单纯攻毒组iNOS的表达在急性期增高，慢性期反见下降。由此可见，母牛菌苗有保护性免疫调节作用，其进行免疫调节的机制很可能是：启动Th1应答，诱导IFN-的产生及iNOS的表达，抑制Th2应答，激活M产生NO，从而抑制或杀死结核分支杆菌。志谢感谢北京市结核病胸部肿瘤研究所段连山主任等的大力支持作者单位：张立群(北京胸科医院100095)马伟路(北京胸科医院100095)笪冀平(解放军空军总医院)王保

24、法(河北医科大学第二附属医院)参考文献：1Kaufmann SHE. Bacterial and protozoal infections in genetically disrupted mice. Curr Opin Immunol, 1994, 6:518-525.2Kumararatne DS. Tuberculosis and immunodeficiency of mice and men. Clin Exp Immunol, 1997, 107:11-14.3谭明旗.结核性胸膜炎患者血清及胸水可溶性IL-2受体的研究.中国免疫学杂志，1997,2:127-128.4万献尧，毕丽岩

25、.结核性胸膜炎与细胞因子. 日本医学介绍，1998，19:26.5庄玉辉，李小明，李国利,等.母牛分支杆菌制剂对T淋巴细胞增殖反应影响的研究.微生物学报，1995，35:292-294.6李晓明，王国治，赵桂芳,等.母牛分支杆菌制剂对小鼠腹腔巨噬细胞产生过氧化氢水平的影响.中国防痨杂志，1996，18：21-22.7王国治，赵桂芳，李晓明,等.母牛分支杆菌通过一氧化氮进行免疫调节.中华结核和呼吸杂志，1996，19:140-142.8Fan XG, Yakoob J, Fan XJ, et al.Enhanced T-helper 2 lymphocyte responses immune mechanisms of Helicobacter pylori infection