浅论AQP4与出血性脑血管病脑水肿的相关性研究

1、浅论AQP4与出血性脑血管病脑水肿的相关性研究 【摘要】 本文对AQP4在中枢系统的分布、作用及其表达的影响因素作了总结性的描述，同时对出血性脑血管疾病脑水肿的形成过程及相关生理病理过程作了说明，并探讨了AQP4在出血性脑血管病脑水肿的病理生理过程中的作用，总结了AQP4与出血性脑血管病脑水肿的相关研究进展。为进一步研究脑水肿提供新思路。 【关键词】 AQP4;脑水肿;出血性疾病;中枢系统Abstract:The present research makes a summary description about the influencing factors of the distribut

2、ion and function of AQP4 in the central nervous system. At the same time, the research also explains brain edema formation process and pathological processes in hemorrhagic cerebrovascular disease and gives a summarization of the relevant study of AQP4 and hemorrhagic cerebrovascular disease cerebra

3、l edema. The research provides new ideas for the further studies on the brain edema.Key words: Aquaporin-4; cerebral edema; cerebrovascular disease; central nervous system出血性脑血管病是中老年人的一种常见病、多发病，具有高致残率、高病死率的特点。其致神经功能损伤的原因主要有以下几个方面：出血相关的损伤;继发性脑水肿相关的损伤;缺氧相关的损伤等。 其中脑水肿的病理损伤作用在整个神经功能损伤过程中致关重要，然而临床对于脑水肿的治

4、疗还只处于渗透性利尿或外科减压阶段，缺少针对脑水肿形成机制的治疗。近年来，对于水肿形成机制的研究有了长足的进展，其中水通道蛋白(AQP)家族是新近发现的首个涉及特异性转运水分子的细胞膜蛋白家族。而在AQP家族中以APQ4对于脑水肿的形成最为重要1，故对AQP4的研究成了寻找治疗脑水肿的新途径。本文对AQP4与出血性脑血管病的相关研究作一综述。1 AQP4概述1.1 AQP4的发现AQP即水通道蛋白，1988年Agre首先在细胞上发现，纯化后发现其对水有选择性极高的通透性，目前已发现11种AQP，广泛存在于细菌、植物、动物体内。各物种AQP差异性不大，具有高度同源性。水通道蛋白4(aquapor

5、im4,AQP4)是1994年jung等利用水通道蛋白家族的同源性克隆分离出来的，在中枢神经系统分布最为丰富，参与了脑脊液的重吸收、渗透压调节。实验已证实水分子的跨膜运动有90%是通过AQP实现的，仅10%是通过弥散作用实现的。1.2 AQP4的分子结构和遗传特性AQP4是由4个具有独立活性的亚单位组成的四异聚体，其氨基端和羧基端均位于胞内，整个分子前后两部分在序列上相似，呈1800定位的正面对称结构。每个亚单位含有6条疏水性的跨膜a右手螺旋结构，均有独立运水的孔道。各亚单位间有5个长度不同的连接环(A、B、C、D和E环)，A、C、E环为胞外环，B、D环为胞内环。A、C、D环为3个不同长度的连

6、接环;B、E环为2个功能性的长环，分别含3个主要为天冬、脯、丙氨酸NPA环从双分子层相对的面折叠入膜中，在双分子层中线处交叉重叠形成了狭窄的开放水孔道，且周围被6条跨膜的螺旋所包绕。分子重组体研究证实其每个单位的孔道呈“沙漏”模型。胞外A环和C环上的组氨酸决定AQP的PH依赖性，其位置的不同可调节AQP对酸碱的敏感性。AQP4的组氨酸位位于C环129位，碱性环境可增加其对水的通透性。AQP4水通透性不会被汞剂抑制，因为其B环的NPA序列前无半胱氨酸，所以又称汞不敏感性水通道蛋白。此外，AQP4羧基端有一个PDZ相互作用序列(丝氨酸-丝氨酸-缬氨酸)，是合适的亚细胞靶位点。AQP4的独特性在于其

7、固有的高水通透性以及它是膜上颗粒正交排列阵的组成部。AQP4是以单体合成的，其2种亚型(M1:323个氨基酸;M23：301个氨基酸)均在脑内表达，以M23更为丰富，共同组成四聚体形式存在于细胞膜上。每个单体含有一个直径约0.38 nm的水孔通道(稍大于水分子直径)，可使水分子顺渗透压梯度双向转运。AQP4的基因由4个外显子组成，分别编码127、55、27、92位氨基酸序列，其间有3个内含子，其长度分别为0.8、0.3和5.2kb。Lu等用原位杂交免疫荧光法观察发现，AQP4基因定位于人的染色体18q11.2与q12.1之间的连接处。叶志军，等：AQP4与出血性脑血管病脑水肿的相关性研究辽宁医

8、学院学报 2009年12月，30(6)2 AQP4在中枢神经系统中的分布在脑中，AQP4的一个主要表达区域是形成胶质界膜的致密星形足突，而胶质界膜是与脑脊液接触的软脑膜和室管膜表面的屏障;另一个高度极性化表达的区域是血管周围的星形细胞足突;此外，在下丘脑的一些渗透压调节区域中，也有AQP4表达。在下丘脑巨细胞核中，富含AQP4的胶质层被发现与巨细胞神经元直接接触;在脊髓中，AQP4除了在血管周围呈极性表达外，在灰质中与神经元胞体和突触直接接触的胶质细胞足突也有丰富的表达。AQP4主要在水中转运位点呈高表达及其对水通透的高度选择性，表明其在脑中的重要作用是在胶质细胞、血、脑脊液间进行水的调节，从

9、而维持脑的水盐平衡。3 AQP4在中枢神经系统中的功能AQP4蛋白功能尚不完全明确，在AQP4基因敲除小鼠并未显示明显的神经功能异常。其相关生理功能研究如下。3.1 参与对中枢神经系统水、电解质的调节在中枢神经系统中， AQP4为星形胶质细胞提供了一个快速的水转运通道，从而使星形胶质细胞实现调节水、电解质的平衡。Solenov等观察发现：AQP4缺乏的星形胶质细胞对水的通透性能较野生株低7倍。星形胶质细胞通过AQP4对水的快速转运来调节中枢神经系统水、电解质平衡的另一个途径是对钾离子的调节。在神经活动期间，有大量钾离子释放于细胞外空间。星形细胞对钾离子的阻留，是保证细胞内外钾离子平衡的重要手段

10、。实现这一功能的重要构件之一是星形细胞膜上的内流型整流钾离子通道。实验表明：AQP4与Kir4.1在一些神经组织呈复合表达模式。故有学者认为：AQP4在中枢神经系统中的一个重要作用就是通过允许水的快速转运而促进星形胶质细胞通过Kir4.1对钾的摄取。3.2 参与部分感觉冲动的传导研究发现，在鼠内耳Corti器邻近毛细胞支持的上皮细胞中有AQP4的表达。Li等观察了AQP4敲除鼠的听觉脑干反应(ABR),研究结果发现：在CD1基因背景下，45周龄AQP4敲除鼠的ABR刺激阈较野生鼠增加了20db以上;在C57/B16背景下，AQP4敲除鼠ABR缺如，而野生鼠则存在。光镜下，两种鼠无形态上的差异。

11、这些研究结果表明;AQP4在听觉冲动的传导中起了一定的作用，其原因可能与AQP4能使上皮细胞快速渗透平衡有关。在视网膜上，AQP4表达于紧靠双极细胞的Muller细胞。研究表明;AQP4敲除鼠的视网膜图的B波有轻度下降，表明AQP4也参与了视觉冲动的传导，其原因也可能在于水的转运或钾的缓冲31233-31237。3.3 调节神经兴奋性研究表明，细胞内外的相对容积对神经兴奋性有重要影响。Amiry-Moghaddam等研究发现：在高热癫痫模型中，DMD模型鼠(mdx鼠)较野生鼠有更严重的癫痫发作。但对于AQP4调节神经兴奋性的具体机制仍然不清，他们观察了mdx鼠的海马切片，认为AQP4依赖性细胞

12、外钾清除的下降可能是原因之一。3.4 参与脑水肿的发生及发展Manley等159-163对AQP4敲除鼠和野生鼠的水中毒反应进行了比较。证实AQP4可能通过对血管内水的快速转运而促进细胞毒性脑水肿的发生、发展。而AQP4是双向水通道蛋白，不仅允许水进入脑组织中，同样也允许水分子离开脑组织，由此而推测，AQP4在脑水肿的发生、发展过程中也有一定的有益作用。Papadopoulos等10对血管源性水肿的研究在一定程上证实了这一推测。4 AQP4表达的调节AQP4的调节在基因水平和分子水平上均可发生。4.1 AQP4的短时程调节AQP4的短时程调节主要是通过蛋白质磷酸化。在AQP4上有蛋白激酶A(P

13、KA)、钙/钙调素依赖蛋白激酶(CaMK)、蛋白激酶C(PKC)、酪蛋白激酶(CK)磷酸化位点。已证明PKC激活后降低了AQP4基因表达和蛋白含量;Yamamoto等11则发现改变PKC活性，可以明显改变胶质细胞AQP4及其mRNA表达水平;也有报导蛋白激酶活化剂具有导致AQP4磷酸化后活性消失的作用;AQP4与血浆蛋白相互作用可以阻止PKC依赖的Ser180磷酸化，却有利于CaMK作用的Ser111磷酸化12。4.2 AQP4的长时程调节长时调节为转录水平调节，使AQP4合成增多，mRNA和蛋白表达显着增强。并已证实糖皮质激素和B肾上腺素能受体激动剂可以增加AQP4mRNA表达，而可的松在原

14、代培养的星形胶质细胞上并不影响AQP4Mrnat 蛋白表达。Fujita等13发现低氧会下调星形胶质细胞AQP4mRNA和蛋白表达，再给氧后AQP4水平迅速恢复。Miyajima等14发现在培养的星形胶质细胞中加入CNP可通过GCB使AQP4mRNA的表达增强。另外，Gu等15发现睾酮可以提高AQP4及其mRNA在培养的星形胶质细胞中的表达水平，改善星形胶质细胞高渗环境的渗透脆性，且该作用可被TPA削弱。 4.3 AQP4受亚结构定位变化及其膜锚定蛋白syntrophin的调节通过改变AQP4在细胞内亚结构的定位，同样可以导致其生物效应的变化。AQP4 C端第276280的5个氨基酸对于AQP

15、4在细胞膜上的固定起着重要作用，他们的突变或缺失将导致AQP4不能固定在细胞膜上，从而进一步影响其生物学效应。4.4 其他因素Li等16发现低渗环境可导致星形胶质细胞水肿和生存能力下降，AQP4mRNA和蛋白表达增强，证实了AQP4的表达与渗透压直接相关。由甘露醇诱导的高渗环境可以增加AQP4和AQP9的表达，颅内注入甘露醇可以增加大鼠皮质AQP4和AQP9的表达，软脑膜和血管周围的表达均增加，Arima等17认为甘露醇诱导的高渗环境引起AQP4上调的机制与P38MAPK信号通路有关;星形胶质细胞和脑片体外培养于高氨环境出现细胞肿胀，肝性脑病动物模型也有同样发现，AQP4 蛋白表达上调可能参与

16、了这一过程;在内皮细胞与星形胶质细胞共培养体系中免疫荧光染色发现AQP4出现明显地重新定位18。与胶质细胞单独培养比较，与内皮细胞接触紧密的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色阳性的细胞，AQP4 染色明显增加。主要是胞膜着色，细胞内没有或着色很淡。胶质细胞岛也表现为膜着色。说明内皮细胞令胶质细胞中AQP4表现出一定的极性分布。共培养体系中AQP4 的定位变化，是受内皮细胞诱导的细胞分化所致，或两种细胞间生理性的相互作用。此外，多巴胺能下调肾上皮的AQP4，但相关的多巴胺受体还不详。AQP4对很多重金属不敏感，但是铅可以引起AQP4增加，而且急性铅中毒可以引起脑水肿19。5 AQP4与出血性脑水肿

17、脑水肿是脑出血后常见的病理现象，脑出血后血肿周围组织水肿在血肿形成时即可发生并快速发展。研究证实脑出血引起的死亡高峰出现在发病数天内，很可能与水肿的进展有关。脑出血后1h血肿周围即可出现水肿，已证实这时的水肿其实是血块收缩，由血肿内的血液成分释放到血肿周围脑组织引起，水肿液为血浆成分。而此时血-脑脊液屏障完整，故脑出血后6h内AQP4表达并不强烈。1天后可能由于激活的凝血酶与星形胶质细胞膜上的凝血酶受体结合对细胞产生直接的毒性作用，使星形胶质细胞表达AQP4蛋白明显增加，导致细胞水肿，血-脑脊液屏障破坏，使通透性增加，并且一直维持到脑出血后3天，形成脑水肿高峰期。此后AQP4蛋白表达逐渐减弱，

18、但依然高于正常，可能与血肿内的红细胞破坏释放出血红蛋白相关。而出血侧皮质AQP4蛋白表达相应升高，可能是对脑水肿后颅内压升高的反应。Manley等159-163的实验证明;AQP4敲除对急性脑水肿有部分保护作用。而在通过MRI观察到的AQP4mRNA的表达增高则与脑水肿的程度相平行。在脑水肿情况下AQP4对血-脑脊液屏障通透性平衡的恢复起关键作用，在大鼠细胞毒性脑水肿实毒性脑水肿实验中观察到细胞内水、钠的滞留，血-脑脊液屏障未见破坏，90 min后AQP4mRNA表达减少。而在血管源性脑水肿中，毛细血管内皮细胞受损，血-脑脊液屏障发生障碍，AQP4蛋白增多，此时AQP4蛋白调节水转运加重了脑水

19、肿的发生20。目前研究进展：脑出血后AQP4过度表达与Ca2+超载可能是出血性脑水肿发生发展的主要原因，AQP4和Ca2+可能共同参与出血性脑水肿形成的信号转导。凝血过程中释放的凝血酶可能通过上调AQP4的水平、直接或间接开放BBB，增加BBB通透性。铁胺干预脑出血后AQP4的变化，发现DFO作为强有力的铁螯合剂可抑制AQP4在水肿高峰期的表达，为未来临床治疗ICH提供了可能的新的干预靶点。亚低温可能通过降低胶质细胞足突上AQP4的表达，减少神经胶质细胞膜进入细胞内的水含量，抑制细胞毒性脑水肿，保护星形胶质细胞的功能，保护其对血管内皮细胞分化的调控功能，加强内皮细胞的紧密连接，保护血脑屏障，进

20、而减少经破坏的血脑屏障进入脑组织细胞间隙的大分子物质及水分，抑制血管源性脑水肿。使用PNS来干预脑出血后AQP4的变化，发现PNS通过抑制AQP4的表达来减轻脑水肿的形成。其机制并不完全，尚待研究。6 展 望目前，对AQP4的研究和认识尚处于起步阶段,仅仅限于确定水通道蛋白4的分布及其表达与脑水肿的形成密切相关,而机体在生理和病理状态下对AQP4表达和调控的分子生物学机制不详。但可以肯定的是,AQP4 的研究有助于人们了解脑水肿发生及消退的病理生理学机制，而且弄清AQP4 在脑水肿的分子机制将有助于开发抑制脑水肿的新药以及发现一种全新抗脑水肿的治疗方案。【参考文献】 1 Donald E G，

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