H_2S介导ABA诱导蚕豆气孔运动的生理机制研究

1、西北植物学报,2011,31(2):0298-0304ActaBot.Boreal. Occident.Sin.文章编号:1000 4025(2011)02 0298 07*H2S介导ABA诱导蚕豆气孔运动的生理机制研究刘 菁,侯智慧,赵方贵,刘 新*(青岛农业大学生命科学学院,山东青岛266109)摘 要:以蚕豆为实验材料,利用药理学实验和分光光度法,研究了ABA处理及ABA与H2S合成抑制剂共处理对蚕豆气孔运动的影响,以及体内H2S水平、H2S合成酶L /D 半胱氨酸脱巯基酶(磷酸吡哆盐依赖性酶)活性变化.结果表明:(1)光下H2S的合成抑制剂羧甲氧基胺半盐酸盐(AOA)、羟氨(NH2OH

2、)、L /D 半胱氨酸脱巯基酶分解产物C3H3KO3+NH3均明显抑制ABA诱导的蚕豆气孔关闭;(2)外源ABA能够明显提高叶片的H2S水平及L /D 半胱氨酸脱巯基酶活性;(3)AOA、NH2OH、C3H3KO3和NH3均可以逆转ABA所引起的H2S水平及L /D 半胱氨酸脱巯基酶活性的升高.研究发现,ABA可通过增强L /D 半胱氨酸脱巯基酶活性,促进L /D 半胱氨酸分解生成H2S,进而诱导蚕豆气孔关闭.关键词:蚕豆;硫化氢;脱落酸;气孔运动中图分类号:Q945.79文献标志码:AHydrogenSulfideMediatesABA inducedStomatalClosureofVic

3、iafabaL.LIUJing,HOUZhi hui,ZHAOFang gui,LIUXin*(CollegeofLifeSciences,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao,Shandong266109,China)Abstract:ThroughpharmacologicalcombinedwithspectrophotographytostudytheeffectsofABAandABAwithinhibitorsofH2SsynthesisonstomatalclosureofViciafabaL.,H2SgenerationandL /D cy

4、s teinedesulfhydrase(pyridoxalphosphatedependentenzymes)activity.TheresultsshowedthatAOAandNH2OH,inhibitorsofpyridoxal 5 phosphate dependentenzymes,C3H3KO3+NH3,productsofL /D cys teinedesulfhydraseallinhibitedABA inducedstomatalclosureofViciafabaL.obviouslyunderlightcon dition.TreatmentwithABAinduce

5、dH2SgenerationandincreasedL /D cysteinedesulfhydraseactivity.AOA,NH2OH,C3H3KO3+NH3reducedH2SgenerationinducedbyABAandtheactivityincreaseofL /D cysteinedesulfhydrase.ThoseresultssuggestedthatABAenhancedtheactivityofL /D cysteinedesulf hydrase,inducingtheaccumulationofH2SviaL /D cysteineresolving,andf

6、inallyinducedstomatalclosureofViciafabaL.Keywords:ViciafabaL.;hydrogensulfide;abscisicacid;stomatalmovement气孔运动是植物对所处环境条件变化和内部发育信号刺激的灵敏反应1,其开闭运动调控着植物*收稿日期:2010 07 22;修改稿收到日期:2010 10 15基金项目:国家自然科学基金(30970288);山东省自然科学基金(ZR2010CM024);植物生理学与生物化学国家重点实验室开放课题(SKLPPBKF09001)作者简介:刘 菁(1984-),女(汉族),在读硕士研究生,主要从

7、事细胞信号转导研究.E mail:liujing2046,.cn2期 刘 菁,等:H2S介导ABA诱导蚕豆气孔运动的生理机制研究299与环境间的气体与水分交换,影响植物的生长与发育过程.因而,气孔运动机制的研究一直是人们普遍关注的问题.植物激素脱落酸(abscisicacid,ABA)参与调控植物生长发育的许多重要过程,并且能够提高植物对干旱、盐害以及低温等胁迫的耐受性2.业已证明ABA能够诱导气孔关闭,从而引发植物对水分储存的增加,进而提高植物的抗旱性3;Ca2+4、过氧化氢(hydrogenperoxide,H2O2)5和一氧化氮(nitricoxide,NO)6等都是ABA诱导气孔关闭过

8、程中的信号组分,这些信号分子组成了复杂的网络.如,H2O2位于胞质碱化的下游,通过调控NO的合成介导ABA诱导的拟南芥叶片气孔关闭的过程7 8.在ABA诱导气孔关闭这一过程中是否还有新的信号分子参与还有待于进一步的研究.硫化氢(hydrogensulfide,H2S)是近年来被作为继NO和一氧化碳(carbonmonoxide,CO)之后的第3种内源性气体信号因子.以动物为材料的研究发现,H2S可以作为一种重要的信号组分参与神经活动的调节、大脑的发育水平以及血管结构的重建等.近年来H2S在植物中的报道越来越多,高等植物的根或叶在硫元素过量时有H2S的释放10 11;H2S作为信号分子调控甘蓝叶

9、片中磷酸吡哆盐依赖性酶的活性以及巯基物质的含量,引起内源H2S含量上升,从而提高植物的抗性12;最近又有研究认为H2S能够提高植物体对非生物胁迫的抵御能力.那么在ABA调控蚕豆气孔运动中是否有H2S的参与?为此,本实验以蚕豆为实验材料,探讨H2S参与调控ABA诱导的蚕豆气孔关闭的可能性.13 1499苏糖醇(dithiothreitol,DTT);0.8mmol/LL 半胱氨酸(L cysteine);0.8mmol/LD 半胱氨酸(D cys teine);30mmol/LFeCl3;20mmol/LN,N 二甲基 对苯二胺(N,N dimethyl p phenylenediaminedi

10、hy drochloride);0.1mmol/LNa2SO4(是NaHS的含硫化合物对照);0.1mmol/LNaAC(是NaHS的含Na化合物对照);配制母液:100 mol/LABA;1.0mmol/L羧甲氧基胺半盐酸盐(aminooxyaceticacid,AOA);1.0mmol/L丙酮酸钾(potasiumpyruvate,C3H3KO3);1.0mmol/LNH3;1.0mmol/LNH2OH;0.2mmol/LNaHS(H2S的供体).其中,ABA、AOA、L 半胱氨酸和D 半胱氨酸均购于Sigma公司,其他药品为国产分析纯.1.3 气孔开度的测定气孔开度的测定参照刘新等15的

11、方法.取生长良好34周龄蚕豆完全展开的叶片,光诱导气孔张开.撕取其下表皮,小心刷除上面粘附的叶肉细胞,用显微测微尺测量气孔的初始孔径,测量时,随机取3个视野,每个视野内随机取10个气孔.然后用各种处理液在光下(光强200 mol m s-2-1+)处理30min.记录终态孔径,每个处理重复3次,结果为3次重复的平均值 标准误差.各种处理依次为:(1)0.05、0.10、0.20mmol/L的NaHS处理表皮条,观察气孔开度,筛选NaHS的最佳浓度.然后以最佳浓度NaHS和相同浓度的Na2SO4、NaAC处理,观察气孔开度,分析H2S对气孔开关的影响.(2)0.1、1、10、50、100 mol

12、/L的ABA处理表皮条,观察气孔开度,筛选ABA的最佳浓度.以最佳浓度ABA分别与0.2、0.4、0.8、1.0mmol/L的AOA、NH2OH和C3H3KO3+NH3处理表达,观察气孔开度,筛选AOA、NH2OH和C3H3KO3+NH3的最佳作用浓度,以验证H2S是否参与ABA诱导的气孔关闭.以单独用表皮条缓冲液(10mmol/LMes/KOH,50mmol/LKCl,0.1 mol/LCaCl2,pH6.1)处理作为对照.洗脱时用各个处理液光下处理30min后,然后转入表皮条缓冲液中,将处理液洗去,光下处理30min,观察气孔开度.1.4 蚕豆叶片H2S含量的测定蚕豆叶片H2S含量的测定参

13、照Sekiya等11的亚甲基蓝法.各种处理后,取0.1g第4叶位叶片加0.9mL20mmol/LTris HCl(pH8.0)匀浆,离心取上清液用于检测,蛋白浓度为100mg/L.将装有1 材料和方法1.1 材料培养蚕豆(ViciafabaL.)种子经10%NaClO表面消毒15min,用蒸馏水洗净后置于培养皿中浸种,在生化培养箱中25 催芽23d后,播种于培养土(营养土和蛭石按2 1混合)中,于光/暗周期12h/12h、光照强度200 mol m-2 s-1、昼夜温度分别为24 和18 、相对湿度60%下培养,34周后取顶端完全展开的叶片进行实验.1.2 药品和试剂试验药品和试剂:表皮条缓冲

14、液(10mmol/LMes/KOH,50mmol/LKCl,0.1 mol/LCaCl2,5300西 北 植 物 学 报 31卷mm 75mm),加入100 L30mmol/LFeCl3(溶于1.2mol/LHCl)和100 L20mmol/LN,N 二甲基 对苯二胺(溶于7.2mol/LHCl)后,将测试管用封口膜迅速封好,37 反应30min,测定670nm波长下吸光度值.用不同浓度的Na2S制作标准曲线.每个处理重复3次,结果表示为3次重复的平均值 标准误差.各种处理如下:(1)1.3中所测最佳浓度ABA分别处理蚕豆植株带叶茎段(去根)0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5h后,测定

15、蚕豆叶片H2S含量及其变化规律.(2)以(1)中H2S含量达峰值时的时间为依据,以最佳浓度ABA分别与最佳浓度AOA、NH2OH、最佳浓度C3H3KO3+NH3处理蚕豆植株带叶茎段(去根)后,测定蚕豆叶片H2S含量.1.5 蚕豆叶片L /D 半胱氨酸脱巯基酶活性的测定蚕豆叶片L /D 半胱氨酸脱巯基酶活性的测定参照Riemenschneide等16nm波长下吸光度值.D 半胱氨酸脱巯基酶活性的测定除了将L 半胱氨酸换成D 半胱氨酸,以及Tris HCl为pH8.0外,其余与L 半胱氨酸脱巯基酶活性的测定完全相同.对照和处理都是3次重复,结果表示为平均值 标准误差.1.6 数据统计用DPS系统进

16、行统计分析.2 结果与分析2.1 H2S对蚕豆叶片气孔开度的影响从图1,A可以看出,0.05、0.1和0.2mmol/L的NaHS(H2S供体)溶液均可以诱导气孔关闭,具有明显的浓度效应.在一定范围内,随浓度增高,气孔开度越小,其中0.2与0.1mmol/LNaHS作用效果相近,但0.2mmol/LNaHS处理后洗脱表皮条的气孔无法恢复到正常开度,因此确定NaHS的最佳作用浓度为0.1mmol/L(P<0.05).为了证明H2S诱导气孔关闭的效应是特异,又观测了其他含硫或含钠化合物溶液(NaAC和Na2SO4)对气孔运动的影响(图1,B).图1,B显示,0.1mmol/LNaHS处理后叶

17、片气孔开度显著减小,而0.1mmol/LNaAC和0.1mmol/LNa2SO4溶液处理后叶片气孔开度没有显著变化.以上结果证明,H2S能够诱导气孔关闭,且具有一定的特异性.2.2 H2S合成抑制剂对ABA诱导蚕豆气孔关闭的影响由图2,A可以看出,0.1100 mol/L的ABA处理后气孔开度均变小,当ABA浓度为50和100别与AOA、NH2OH、C3H3KO3+NH3处理蚕豆植株叶茎段(去根)最佳时间后,取0.1g第4叶位叶片加0.9mL20mmol/LTris HCl(pH8.0)匀浆,离心取上清液用于检测,蛋白浓度为100mg/L.L 半胱氨酸脱巯基酶活性是通过测定L 半胱氨酸(含DT

18、T)释放的H2S来测定的.1mL的反应体系包括0.8mmol/LL 半胱氨酸,2.5mmol/LDTT,100mmol/LTris HCl(pH9.0)和10 g蛋白溶液.加入L 半胱氨酸后置于37 反应30min,最后加入100 L30mmol/LFeCl3(溶于1.2mol/LHCl)和100 L20mmol/LN,N 二甲基 对苯二胺(溶于7.2mol/LHCl)终止反应,测定670图1 NaHS浓度(A)和处理试剂(B)对蚕豆气孔运动的影响Fig.1 EffectsofNaHSconcentration(A)andtreatmentagentia(B)onstomatalmovemen

19、tinViciafabaL.2期 刘 菁,等:H2S介导ABA诱导蚕豆气孔运动的生理机制研究301mol/L时气孔开度几乎相同,由此表明在一定浓度范围内,ABA可诱导蚕豆气孔关闭,且具有浓度效应.洗脱实验显示,当ABA浓度为100 mol/L时气孔开度仍比对照小,且达到显著水平,说明保卫细胞丧失部分活性,通过洗脱表皮条的气孔开度无法恢复到正常开度,表明此浓度的ABA诱导的气孔关闭对细胞造成一定的伤害.当ABA浓度为50 mol/L时被洗脱后气孔开度与对照几乎相同,保卫细胞保持良好的活性,可以通过洗脱使气孔恢复到正常开度,且达到显著水平(P<0.05)(图2,A),据此将50 mol/L作

20、为ABA的最有效浓度,并在以下的实验中以此浓度作为处理浓度.为了探明ABA诱导蚕豆气孔关闭过程中是否有H2S的参与,分别加入H2S合成酶 磷酸吡哆盐依赖性酶抑制剂AOA和NH2OH以及L /D 半胱氨酸脱巯基酶产物C3H3KO3+NH3后观察气孔开度变化.结果表明,一定浓度的AOA、NH2OH以及C3H3KO3+NH3单独处理对气孔开度无明显影响,然而当与50 mol/LABA共处理时,均可不同程度地抑制ABA诱导的气孔关闭,且有浓度效应.AOA、NH2OH和C3H3KO3+NH3的最佳作用浓度分别为0.8mmol/L、0.8mmol/L和0.4mmol/L+0.4mmol/L(图2,BD).

21、综合图1和图2的结果可以进一步证明,由L /D 半胱氨酸脱巯基酶分解L /D 半胱氨酸产生的H2S参与了ABA诱导的蚕豆气孔关闭.2.3 ABA对蚕豆叶片H2S水平及L /D 半胱氨酸脱巯基酶活性的影响2.3.1 ABA对蚕豆叶片H2S含量的影响 在50 mol/LABA处理后,在不同处理时间分别检测其对蚕豆叶片H2S水平的影响.结果表明,蚕豆叶片含有一定浓度水平的内源H2S(图3),ABA可诱导蚕豆叶片H2S含量明显增加(P<0.05),ABA处理3h时H2S含量迅速上升,在6h时含量基本降低到对照水平,且在处理后3h达到最大值(图3).图4显示,ABA处理后叶片H2S含量高于对照,而

22、ABA与AOA、NH2OH和C3H3KO3+NH3共处理时H2S含量与对照相当,表明H2S合成抑制剂均图2 ABA对蚕豆气孔运动的影响(A)以及H2S合成抑制剂AOA(B)、NH2OH(C)和C3H3KO3+NH3(D)对ABA诱导蚕豆气孔关闭的影响Fig.2 EffectsofABAonstomatalmovementinViciafabaL.(A)andeffectsofAOA(B),NH2OH(C)and3H3KO3+NH3(onABA closurinfabaL.302西 北 植 物 学 报 31卷可以完全逆转ABA引起的叶片H2S含量的增加(图4).由此进一步说明H2S参与ABA调控

23、的生理过程.2.3.2 ABA对蚕豆叶片L /D 半胱氨酸脱巯基酶活性的影响 为了探明在ABA诱导蚕豆气孔关闭过程中H2S的主要合成途径,对H2S的主要合成酶的活性进行了测定.由图5可以看出,ABA处理后叶片L /D 半胱氨酸脱巯基酶活性升高,但AOA、NH2OH和C3H3KO3+NH3与ABA共处理时L /D 半胱氨酸脱巯基酶活性没有发生明显变化,表明,50 mol/LABA可明显增加L /D 半胱氨酸脱巯基酶活性;而AOA、NH2OH、C3H3KO3+NH3可部分逆转ABA引起的L /D半胱氨酸脱巯基酶活性的增加(图5,A、B).据此推测,由L /D 半胱氨酸脱巯基酶催化合成的H2S共同参

24、与ABA诱导的蚕豆气孔关闭过程.3 讨 论植物体在逆境条件下往往会发生异常的气孔开闭运动以对逆境胁迫做出响应,许多研究已证明ABA对气孔运动有显著的调节作用.Garcia Mata等报道ABA抑制光诱导的气孔张开;Desikan等5证明ABA诱导气孔关闭.且越来越多的实验结果显示,ABA调控气孔运动的信号转导途径是一个由钙、质子、NO和H2O2等多组分参与的复杂的信号网络,这些信号分子之间存在交叉.例如,Ca2+螯合剂EGTA18和Ca2+通道抑制剂La3+1917图4 H2S合成抑制剂对ABA诱导的蚕豆叶片H2S含量的影响图3 50 mol/LABA对蚕豆叶片H2S含量影响的时间进程Fig.

25、4 EffectsofH2SsynthesisinhibitorsonABA induced(C3H3KO3+NH3);Thesameasbelow图5 H2S合成抑制剂对ABA诱导蚕豆叶片L 半胱氨酸脱巯基酶(A)和D 半胱氨酸脱巯基酶(B)活性的影响Fig.5 EffectsofH2SsynthesisinhibitorsonABA inducedL cysteinedesulfhydraseactivity(A)and2期 刘 菁,等:H2S介导ABA诱导蚕豆气孔运动的生理机制研究303202+de等16发现外源H2S可以诱导拟南芥L 半胱氨酸脱巯基酶活性升高,但是对D 半胱氨酸脱巯基酶

26、活性没有明显影响.本实验对ABA调控气孔运动中H2S的来源进行了初步探讨,发现L /D 半胱氨酸脱巯基酶抑制剂可以完全逆转ABA引起的叶片H2S含量的增加,且ABA能够提高L /D 半胱氨酸脱巯基酶活性,由此推测,L /D 半胱氨酸在L /D 半胱氨酸脱巯基酶的分解作用下生成H2S参与ABA诱导的蚕豆气孔关闭.综合看来,ABA通过增强L /D 半胱氨酸脱巯基酶活性,进而诱导L /D 半胱氨酸分解生成大量的H2S,将信号传递给其下游信号分子,从而诱导蚕豆气孔关闭.但在ABA诱导气孔关闭过程中位于H2S下游的信号分子尚需进一步探讨.本实验利用药理学实验和分光光度法首次证明第3种重要的气体信号分子H

27、2S参与ABA诱导的蚕豆气孔运动,为全面了解H2S在植物体内的生理作用提供了新的证据.在以后实验中可以分离气孔保卫细胞测定H2S含量和L /D 半胱氨酸脱巯基酶活性,在细胞水平证明保卫细胞中存在H2S及其合成酶;通过构建L /D 半胱氨酸脱巯基酶突变体和获得过表达植株,在分子水平证明H2S参与ABA诱导的蚕豆气孔运动,为深入探明H2S的作用机制提供新的依据.此外,在ABA调控气孔运动中有Ca、质子、NO以及H2O2等信号分子的参与,那么它们与H2S是怎样相互作用的,这一过程中除了L /D 半胱氨酸脱巯基酶,H2S的来源还有哪些?最近,以动物为材料的研究结果显示,H2S可以通过PKA和PLC/P

28、KC途径调控细胞Ca水平2+2+252+,由NAPHase途径产生的H2O2可激21活质膜Ca通道,抑制质膜外向K通道,以及+诱导胞质碱化,进而参与ABA诱导气孔关闭过程22.是否还有其他的信号分子参与ABA诱导气孔关闭这一过程中?在ABA诱导气孔关闭信号转导途径中各个信号分子的来源及其信号分子之间的关系还有待于进一步的研究.-.那么,胞质Ca是否位于H2S的下游参与ABA对气孔的调控?这些都需要进一步研究.参考文献:ol.PlantMol.Biol.,2001,52:627-658.2 ZHAOBT(赵宝添),ZHANGQ(张 权),ZHANGQ(张 荃).Researchprogressi

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