脾移植前去除成熟树突状细胞预防移植排斥反应的体外研究

1、脾移植前去除成熟树突状细胞预防移植排斥反应的体外研究【摘要】目的建立治疗性单抗溶液持续灌注大鼠脾脏模型，应用抗大鼠树突状细胞单克隆抗体（WZD）降低大鼠移植脾的免疫原性。方法以WZD溶液持续灌注移植脾，筛选最佳方案，并观察灌注后混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte culture，MLC）淋巴细胞增殖情况及脾细胞的超微结构，以及灌注后移植脾细胞的免疫组化情况。结果WZD灌注组MLC淋巴细胞增殖能力明显降低，与对照组及应用CsA组相比差异有显著意义(P0.05），21灌注组脾细胞功能活跃，线粒体损伤小，灌注后移植脾DC呈现强荧光染色。结论移植脾在21下，每小时给予灌注50 ml单抗

2、溶液灌注获得了最佳效果，WZD溶液灌注移植脾，可去除成熟树突状细胞，确能降低其免疫原性，有可能减少免疫抑制剂的应用剂量。【关键词】树突状细胞；脾脏移植；肾灌注；移植排斥反应In vitro study on prevention of graft rejection with pretreatment of donor spleen by elimination of dendritic cellsCHEN Tianyu, JIANG Hongchi, SUN Bei.(Department of General Surgery, the First Clinical School, Harb

3、in Medical University, Harbin 150001)【Abstract】ObjectiveTo reduce immunogenicity of the donor spleen, we established a rat model of continuous perfusion of spleen with therapeutic anti-dendritic cell monoclonal antibody (WZD). MethodsThe donor rat spleen was continuously perfused with WZD to select

4、the best protocol. Then the lymphopoiesis was examined with mixed lymphocyte culture (MLC) and the splenic cells were observed microscopically and immunohistochemically. ResultsLymphopoiesis was significantly inhibited in WZD-perfused group as compared with the control and cyclosporine A (CsA)-treat

5、ed groups (P0.05). The function of splenocyte in the grafts perfused at 21 was more active and the mitochondrial injury was slight. ConclusionsThe best effect can be obtained by perfusion with WZD at a speed of 50 ml/h at 21. Perfusion of the spleen with WZD before transplantation may reduce the imm

6、unogenicity of the graft and the dosage of immunosuppressive agents.【Key words】Dendritic cell；Spleen；Transplantation；Perfusion；Antibody现代器官移植学认为，有效地诱导受体对移植物的免疫耐受是解决移植排斥反应的最理想办法。而降低移植物的免疫原性及受体的免疫反应性是目前诱导免疫耐受的可行途径。树突状细胞（dendritic cells，DC）是一类具有最强抗原提呈功能的异质性细胞群体，是激发机体免疫反应最原始的细胞。近20年来的研究不断证实，DC是移植排斥反应的重要

7、参与者，但作为嵌合细胞的主要成分，DC的某些类型又可诱导免疫耐受1。持续低温机械灌注是保存移植器官最为满意的方法，但采用此法将某种治疗性单克隆抗体溶入灌注液，对移植物进行持续灌注，减轻排斥反应的报道甚少，在脾脏移植领域内尚无报道。本研究拟通过复制器官灌注模型，在灌注液中加入抗大鼠树突状细胞单克隆抗体（WZD），摸索最佳的治疗性单抗灌注方案，并以体外模式观察并比较WZD与CsA对大鼠同种异体移植排斥反应的抑制作用，探讨DC与移植排斥反应的关系，以及不同温度下持续灌注对大鼠脾脏损伤的影响，为下一步研究提供理论依据。材料与方法1.实验动物分组：63只健康SD大鼠，雌雄不拘，体重(25020) g，由

8、中国科学院动物研究所提供，随机分为9组，每组7只，作为供体。PF为不加单抗的灌注组（对照组）；4MP1，4MP2和4MP3分别为4灌注单抗溶液25 ml，50 ml和100 ml组；21MP1，21MP2和21MP3分别为21灌注单抗溶液25 ml，50 ml和100 ml组；IS为应用免疫抑制剂组；MP+IS为最佳单抗灌注方案加免疫抑制剂组。21只健康Wistar大鼠，雌雄不拘，体重(30050) g，由本校动物实验中心提供，作为受体。2.主要药品、试剂及仪器：WZD，镇江医学院免疫教研室提供，WMO-1号器官保存液（自制），环孢素A（CsA，Pharmacia），电子输液泵（Braun），

9、氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TdR，中国原子能物理研究所），-液体闪烁计数仪（Beckman），RPMI 1640（Gibco），异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白单抗（北京军事医学科学院邦定生物医学公司提供）。3.动物模型建立及灌注方法：术前动物禁食12 h，用1%戊巴比妥钠溶液（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，以04 WMO-1号液通过腹腔动脉原位灌洗脾脏，直至流出液清亮，无菌取脾置于无菌超净工作台上，取WZD与灌注液以120混合并轻轻摇匀溶解，各单抗灌注组通过输液泵给予WZD溶液灌注1 h；PF组给予WMO-1号液灌注1 h；IS组在术前7 d开始每日通过尾静脉给予CsA（5 mg

10、/kg）。4.指标检测及方法：(1)MLC： SD大鼠移植脾细胞为反应细胞。将移植脾修剪去掉脂肪及结缔组织，置于5 ml玻璃瓶中，用眼科组织剪剪碎，Hanks液冲洗，200目不锈钢筛网过滤，以RPMI 1640细胞培养液反复离心冲洗3次，制成细胞悬液。细胞计数板计数，以含20%小牛血清RPMI 1640培养液将细胞悬液浓度配成2105/ml备用，台盼蓝染色测定细胞存活率，所有组的细胞悬液存活率均97%2。刺激细胞为Wistar大鼠外周血单核细胞，断头取血法取血，肝素抗凝，采用密度梯度离心法，在10 ml离心管中依次加入比重为1.14的Ficoll-Hypaque溶液，比重1.13溶液，比重1.

11、12溶液，比重1.08溶液各2 ml，制成密度梯度，按常规叠加2倍稀释的肝素抗凝血2 ml。离心后，从血浆与上层梯度液界面间取出单核细胞，洗涤后，以含20%小牛血清RPMI 1640培养液配成2105/ml的细胞悬液。刺激细胞经137Cs（Gamma cell 40）25 Gy照射处理，以使刺激细胞失去增殖能力。用U型底96孔板分别加入反应细胞和刺激细胞各100 l，并设不加刺激细胞对照孔，每孔终体积为200 l。置37，5% CO2和饱和湿度下培养6 d，终止反应前12 h每孔加3H-TdR 18.5 kBq，用多头细胞收集器采集细胞，用-液体闪烁仪测定3H-TdR的掺入量。(2)4和21灌

12、注后移植脾细胞透射电镜观察。(3)移植脾细胞的免疫组织化学染色观察：将经单抗灌注的移植脾制成细胞悬液，用pH 7.2的PBS离心洗涤（1000 r/min,5 min）,制成细胞涂片，将细胞涂片浸入95%酒精中固定，PBS振洗3次，每次5 min，吹干。滴加异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白单抗，置湿盒内，37保温3060 min。PBS振洗2次，每次5 min，然后用蒸馏水振洗1次。用50%缓冲甘油封片，显微镜下观察。5.数据处理:最佳灌注方案的筛选应用方差分析，PF，MP，IS和MP+IS组的组间对比采用SNK检验。数据由SAS软件统计处理。结果1.WZD溶液移植前持续灌注的最佳方案选择

13、结果：见表1和表2。表1不同温度及单抗用量对MLC淋巴细胞3H-TdR掺入量的影响（s）组别3H-TdR 淋巴细胞掺入量（L/min）4MP14860.101250.36 4MP2 1219.18266.42 4MP3 1205.83359.19 21MP1 4465.17109.16 21MP2 21MP3 6组间比较采用F检验，F=200.36 ,PFA 10.3435 B 2 18.91703126 A*B 2 分析结果表明，灌注温度就其本身对单抗的灌注效果无影响（P=0.3435），而单抗灌注量对灌注效果的影响具有极显著意义(P=0.0001)，二者存在交互作用(P=0.0419)。综

14、合以上统计结果，我们选择21MP2组作为最佳方案。2.各组淋巴细胞增殖能力的检测结果:与PF组相比,各供体预处理组大鼠脾脏淋巴细胞的3H-TdR掺入量明显降低，尤以21MP2组为著。各组间的SNK检验结果显示，21MP2与MP+IS两组间差异无显著（P0.05），但这两组淋巴细胞的3H-TdR掺入量明显低于IS组和PF组（表3和表4）。表3各组淋巴细胞的3H-TdR掺入量（s）组别3H-TdR 淋巴细胞掺入量（L/min）PF9361.34991.86 ISMP+ISMP表4各组间SNK检验结果SNK分组均数例数组别A9361.3 7 PFB 2241.0 7 IS C 1154.4 7 MP

15、+ISC 1095.3 7MPSNK分组以P0.05)；PF组、IS组与以上两组比较差异有显著意义（P0.05）。34和21灌注后移植脾细胞透射电镜观察结果：移植脾细胞的形态、发育情况正常，值得注意的是21灌注条件下移植脾细胞功能活跃，且线粒体损伤小。4移植脾细胞的免疫组织化学染色观察，发现树突状细胞呈现强荧光着色。 讨论1.移植器官应用治疗性单抗溶液持续灌注的方法：Oko等3应用21抗MHC-类分子阳性细胞单抗溶液，保持灌注压小于150 mm Hg，在输液泵控制下，以0.8 ml/min的速度从大鼠肾动脉持续灌注移植肾1 h，实验组移植物存活超过150 d。间断性常温灌洗可使移植肾保存时间延

16、长至6 d。Oko等利用这一进展，同时加入单抗取得满意结果，并推测短暂的常温灌注不但对移植器官没有损伤，相反对移植器官可能具有一定的保护作用，这种保护作用可能与抑制血管内皮的损伤有关3。本实验结果显示21MP2（21，50 ml）组获得了最强的抑制MLC淋巴细胞增殖的效应，这与Oko等的结论相符，其原理推测可能为：21较4更接近于生理状态，单抗与细胞表面特异性抗原结合的活性增高，因而杀伤的DC数量亦随之增高；25 ml，50 ml，100 ml灌注组之间相比，25 ml灌注组效果最差，而50 ml，100 ml灌注组并没有表现出明显差异，这可能与单抗剂量有关；灌注液的持续机械冲洗，造成组织中D

17、C及单核巨噬细胞等抗原提呈细胞的丢失，而灌注液体量越大，这些细胞成分丢失就越多3。传统移植器官保存方法均采用04低温灌洗、器官保存液保存，或低温持续灌注的保存方法。然而本实验中电镜观察结果表明，21灌注条件下移植脾细胞功能活跃，且线粒体损伤小。此现象文献中尚无报道，可能由于21持续灌注的保存方式更有利于大鼠脾细胞的正常生理代谢，亦或观察到的细胞功能状态是脾细胞走向衰亡的过渡期，这有待于进一步研究证实。2树突状细胞单克隆抗体对脾脏移植排斥反应的抑制作用：树突状细胞作为专职性抗原提呈细胞，其最大的特点是能够显著刺激初始型T细胞（naive T cells），并传递T细胞活化信号，是激发机体免疫反应

18、的最原始细胞，在免疫应答的诱导中具有举足轻重的地位。在移植免疫学中供者不成熟DC倾向于引起免疫耐受，成熟DC倾向于引起免疫排斥的观点已被大量实验证实，DC的不均一性对移植免疫中排斥或耐受的调控具有相当重要的作用4。树突状细胞的移行和迁移特性以及其成熟过程已经被大量实验所证实，在非淋巴组织内，DC主要是经过前体阶段的未成熟DC，其表面缺乏MHC分子及CD40，CD54（ICAM-1），CD86（B7-2）5。但这类细胞却富含Fc受体、介导胞饮受体、溶酶体，并表现出吞噬细胞活性，具有极强的摄取和加工处理抗原的能力，但其刺激静息T细胞能力较弱，在同种混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte

19、 reaction, MLR）中刺激作用也较小。DC活化后，通过血管、输入淋巴管等转移至二级淋巴组织，并定居于T细胞富含区。在此与静息的抗原特异性T细胞聚集，发育成为成熟DC，并将处理过的抗原提呈给T细胞，激发初始免疫应答。成熟DC合成高水平的IL-12、高水平表达MHC产物、细胞间粘附分子（CD54，CD58等）、共刺激因子（CD40，CD86等）具有刺激静息T细胞能力，并激发排斥反应，由此可见脾脏中的DC绝大多数应为成熟DC7。许化溪等6利用SD大鼠脾脏DC免疫BALB/c小鼠，经细胞融合产生了抗大鼠DC的McAb（WZD），并通过间接荧光染色和细胞毒性试验证明WZD对新鲜提取的大鼠脾脏D

20、C有明显的杀伤作用。鉴于脾脏DC绝大多数为成熟DC，因此有理由推测WZD杀伤的是成熟DC。本实验利用WZD溶液持续灌注移植脾，通过免疫组化观察证实确能去除其中的成熟DC，同种MLR的淋巴细胞增殖能力显著降低，且其效果明显优于应用CsA组。MP+IS组与21MP2组之间相比无明显差异，说明WZD单抗灌注有可能在一定程度上减少免疫抑制剂的应用剂量，甚或摆脱免疫抑制剂的应用，这也正是现代器官移植学所追求的目标。本实验通过去除成熟DC，阻断了供者DC对T细胞的激活作用，减少移植物的免疫原性，在体外模式中达到了降低脾移植排斥反应的目的。唯感不足的是WZD与DC的表面特异性抗原结合位点现正在鉴定中，因此本

21、试验未能从根本上证实WZD灌注去除大鼠移植脾中DC的亚型及其成熟程度。WZD移植前灌注大鼠脾脏对预防大鼠同种脾移植术后的排斥反应和(或)移植物抗宿主反应的疗效，还有待体内试验进一步证实。作者单位：陈天宇(150001哈尔滨医科大学第一临床学院普外二科)姜洪池(150001哈尔滨医科大学第一临床学院普外二科)孙备(150001哈尔滨医科大学第一临床学院普外二科)参考文献1，Oconnell PJ， Burlingham WJ.Donor dendritic cell persistence in organ allograft recipients in the absence of immunosuppression. J Leukoc Biol, 1999,66:2301