轻度修饰低密度脂蛋白对血管内皮细胞粘附功能影响及其机理初探

1、轻度修饰低密度脂蛋白对血管内皮细胞粘附功能影响及其机理初探    轻度修饰低密度脂蛋白对血管内皮细胞粘附功能影响及其机理初探    中国病理生理杂志 2000年第10期第16卷 论著    作者：刘春华钱冠清刘会齐刘晓辉    单位：中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所，天津 300020    关键词：内皮细胞；低密度脂蛋白类；LDL；粘连    摘

2、要目的：观察轻度修饰LDL (MM-LDL)对培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与人类单核细胞系U937粘附功能及其表面粘附分子表达的影响。方法：利用计数法观察经MM-LDL作用的HUVEC与U937细胞的粘附率；用ELISA方法检测MM-LDL作用后HUVEC膜表面粘附分子血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及P选择素(P-selectin)的表达。结果：MM-LDL(75 mg/L)作用HUVEC 4 h后，其对U937细胞粘附率明显增加(P0.01)，HUVEC膜表面未见VCAM-1，ICAM-1，P-selectin表达上调，作为阳性对照重组肿瘤坏死

3、因子(rTNF)5.0 g/L可显著诱导以上3种粘附分子表达。延长MM-LDL与HUVEC作用时间至18 h可诱导产生P-selectin表达，对VCAM-1表达无影响。结论：MM-LDL诱导的HUVEC与U937粘附不是通过ICAM-1、VCAM-1介导的，P-selectin可能起一定的作用。    中图分类号R543.5； Q256文献标识码A    文章编号1000-4718(2000)10-0887-04    Effect of mininally modifie

4、d low density lipoprotein on the adhesive    function of vascular endothelial cell and its mechanism    LIU Chun-hua QIAN Guan-qing LIU Hui-qiLIU Xiao-hui    （nsitute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences and   &

5、#160;Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China）    AbstractAIM: To observe the effect of MM-LDL (minimally modified LDL) on the interaction between human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and U937 monocyte-like cell line and the exporession of vascular cell adhesi

6、on-1 (VCAM-1), intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1), P-selectin.METHODS:The adhesive percentage between HUVEC treated with MM-LDL and U937 was determined by counting and the expression of VCAM-1, ICAM-1, P-selectin were examined by ELISA. RESULTS: Treatment of HUVEC with MM-LDL (75mg/L) for 4 h

7、ours significantly increased adhesion of U937 to HUVEC (P0.01) and did not induce the surface expression of VCAM-1, ICAM-1, P-selectin . Recombination tumor necrosis factor-alpha (rTNF) 5.0 g/L， as a positive control, induced the expression of these adhesion molecules (P0.05). Prolonged (18 h) expos

8、ure to MM-LDL resulted in the expression of P-selectin, but not VCAM-1. CONCLUSION: the adhesion of monocytes to endothelial cells induced by MM-LDL is not mediated by VCAM-1, ICAM-1. P-selectin induction may be partly involved in the process.    MeSHEndothelium; Cells; Lipoprote

9、ins, LDL; Adhesions    血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)活化是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)发病的始动环节，WBC特别是单核细胞(monocyte, MC)与活化VEC粘附并迁移集聚于内膜下，摄取氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)形成泡沫细胞是AS发病的早期病理表现。其中，MC与活化VEC粘附是最早的细胞行为。食饵性及遗传性高胆固醇血症兔模型脂肪条纹出现在动脉内膜前已有大量MC粘附1。哪些因素促进VEC与MC粘附是被关注的课题。研究表明，Ox-LDL尤其轻度修饰LD

10、L(minimally modified LDL, MM-LDL)具有多种生物学活性，AS损伤处的Ox-LDL氧化程度远比脂质条纹中的Ox-LDL要小，且体外用铁氧化LDL形成的MM-LDL与血循环中的Ox-LDL极为相似2。MM-LDL是否在始动AS发生中亦起着作用?本研究目的在于探讨MM-LDL对VEC粘附功能的影响以及其机理，为阐明AS的早期发生机制及防治提供依据。    材料和方法    一、细胞培养    (一)人脐静脉内皮细胞(human umbilical ve

11、in EC, HUVEC)采用改良Jaffe法3。通过显微镜形态    观察及抗Von Willebrand因子抗体免疫荧光标记鉴定，以12传代培养。本实验所用细胞为第1、2代。    (二)U937细胞U937细胞是人单核细胞系，由本所免疫室惠赠，用RPMI-1640培养液(美国GIBCO BRL公司)在37、5%CO2温箱内培养。实验前用台盼兰染色，活性95%。    二、MM-LDL的制备    LDL购自医科院基础所(利用密度梯

12、度离心法分离)。用铁氧化方法4获得MM-LDL。用Lowry法测LDL蛋白质含量，TBA反应法测定MM-LDL氧化程度。本实验所用MM-LDL的MDA含量为2.46-3.86 mol/g，未氧化前的LDL含量为0.78 mol/g。    三、U937和HUVEC粘附实验    用直接计数法5。HUVEC培养在24孔培养板内待完全汇合后，按以下分组加入含有或不含有刺激剂的M199培养液作用4 h。对照组：M199培养液；MM-LDL刺激组：M199培养液内含终浓度为75 mg/L的MM-LDL，即M199+MM-L

13、DL(终浓度为75mg/L)；阳性对照组：M199+rTNF(终浓度5.0 g/L)。加入浓度为1×106/孔U937细胞温育30 min后去除未结合的U937细胞。于显微镜下计数未结合的U937细胞数。利用下列公式计算出粘附率。        四、ELISA法检测HUVEC表面粘附分子    HUVEC培养在96孔板内待完全汇合后加入含有或不含有刺激剂的M199培养液在37、5%CO2条件下孵育4 h或18 h。经FAB固定液固定，0.1%的牛骨明胶封闭后，加入抗

14、细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1， ICAM-1)(phamingen USA)，抗血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion-1,VCAM-1)(phamingen USA)或抗P-selectin(phamingen USA) mAb 50 L温育60 min。加入辣根过氧化物酶标羊抗鼠IgG 50 L，于37湿盒内温育60 min，经底物缓冲液避光显色30 min后终止反应，测定492 nm处的光吸收值(OD492)。    五、统计处理：  

15、0; 结果用平均值±标准差(±s)表示，组间差异显著性测验用t检验。    结果    一、MM-LDL对HUVEC与U937粘附的影响    MM-LDL 75 mg/L与HUVEC温育4 h组U937的粘附率明显增加，为(30.39±5.23)%(n=7)，对照组为(4.50±1.01)%(n=7)，两组间差异显著(P0.01)。阳性对照组rTNF 5.0 g/L粘附率为(41.3±1.16)%(n=3)(图1)

16、。        Fig 1The effect of MM-LDL on U937 cell adhesion    to HUVEC. ±s. n=7.    * P0.01 vs control.    1MM-LDL对HUVEC与U937细胞间粘附的影响    二、MM-LDL对HUVEC表面粘附分子表达的影响  

17、60; HUVEC经rTNF 5.0 g/L作用4 h，其表面粘附分子VCAM-1，ICAM-1，P-selectin表达均增高(P0.05)；MM-LDL 75 mg/L作用于HUVEC 4 h组未见到VCAM-1，ICAM-1，P-selectin表达变化(表1)。MM-LDL 75mg/L作用于HUVEC 18 h不影响其VCAM-1的表达，增加HUVEC表面P-selectin的表达；短时间(30 min)孵育对P-selectin的表达无作用(表2)。    表1MM-LDL对HUVEC膜表面粘附分子的作用(4 h) 

18、60;  Tab 1The effect of MM-LDL on adhesion molecules    in HUVEC (4 h) (±s)            Groups    VCAM-1    P-selectin    ICAM-1   

19、         n    OD492    n    OD492    n    OD492            Control    8

20、0;   1.231±0.288    7    0.721±0.211    5    1.398±0.063            MM-LDL    75 mg/L    8

21、    1.147±0.258    7    0.952±0.340    6    1.371±0.103            TNF    5.0 g/L    

22、8    *    4    1.245±0.287    6    *            P0.01，P0.05 vs control.表2MM-LDL对HUVEC膜表面粘附分子的作用    Tab 2The effect

23、of MM-LDL on adhesion molecules    in HUVEC (x±s)            Groups    P-selectin    VCAM-1              

24、  n    OD492    n    OD492            Control    7    0.721±0.2106    1.295±0.315   &

25、#160;        MM-LDL 75 mg/L            30 min    7    0.778±0.241            4 h  

26、60; 7    0.952±0.340            18 h    4    1.110±0.245    61.575±0.318           &#

27、160;rTNF 5.0 g/L    4    *    *            P0.05，P0.01 vs control.讨论    MM-LDL对AS的作用已引起众多学者的注意，发现它能活化VEC，刺激VEC释放单核细胞趋化蛋白-1和单核细胞集落刺激因子等；用MM-LDL处理的VEC特异性对MC而不是中性粒

28、细胞粘附增加，而MC又是AS脂质条纹中的主要浸润细胞。因此，MM-LDL在AS发生早期极为重要。从我们的实验结果看出，未经刺激的HUVEC对U937的粘附率很低，而经MM-LDL 75 mg/L处理4h后的HUVEC对U937粘附率增加约6.7倍。我们所得结果与文献报道一致5。此外，细胞因子rTNF 5.0 g/L处理HUVEC 4 h后也引起U937显著粘附于内皮细胞(P0.01)。    WBC集聚于内膜下是多步骤过程，涉及到WBC在VEC上滚动，活化WBC粘着及穿内膜迁移，而每一步都有不同粘附分子介导。目前已经证明，VEC表面粘附分子VCAM-1与

29、ICAM-1是介导WBC粘附于VEC的重要分子，尤其VCAM-1在早期AS模型MC浸润前即已于VEC膜上高表达。这两种粘附分子均可被炎性细胞因子如TNF、IL-1所诱导表达1。为了探讨MM-LDL增加VEC对MC粘附机制，我们用ELISA方法检测了MM-LDL 75 mg/L处理HUVEC 4 h后细胞膜上VCAM-1及ICAM-1的表达。结果显示两种粘附分子表达均未增加，经rTNF 5.0 g/L处理4 h后的HUVEC则均明显诱导VCAM-1、ICAM-1表达，这说明MM-LDL所引起的VEC与U937细胞粘附并不是通过VCAM-1及ICAM-1介导的。我们延长了VEC与MM-LDL作用时

30、间，在作用18 h后仍不能诱导细胞表面VCAM-1的表达，这些结果与Kim5、Galdern等6的报道一致。Galdern等6观察MM-LDL作用24 h后也未见HUVEC膜表面VCAM-1表达上调。    Sakai等1发现在覆盖AS斑块的VEC中有P-selectin的表达；Vora等7用MM-LDL作用于兔主动脉EC可见到P-selectin mRNA增加数倍，提示P-selectin在AS发病中起一定作用。P-selectin属于细胞粘附分子中选择素家族成员，贮存于VEC的Weibel-Palade小体及静止的血小板中，当被炎性介质如组胺，凝血酶

31、刺激后，快速转位到细胞表面表达，介导各种WBC在血管内膜上滚动，在WBC粘附于VEC这一过程中起着启动作用。为了探讨P-selectin在MM-LDL活化HUVEC粘附中的作用，我们首次系统观察了MM-LDL 75 mg/L作用HUVEC 0.5 h、4 h、18 h 3个不同点其膜表面P-selectin的表达。结果发现，只有18 h作用组P-selectin的表达增加，0.5 h和4 h作用组与对照组无差异。Vora等7曾报道MM-LDL作用HUVEC 6 h不能促进P-selectin表达，却增加P-selectin在VEC Weibel-Palade小体内的贮存，而当高度氧化Ox-LD

32、L、组胺再刺激后则P-selectin立即转位到细胞膜上表达。我们的结果也显示MM-LDL诱导的MC集募起一定作用。    本结果提示，MM-LDL具有促进VEC与WBC粘附作用。ICAM-1， VCAM-1不参与MM-LDL诱导的VEC与MC粘附，P-selectin在其中有一定意义。这一机制可能在AS发病早期MC集募中起作用。最近文献报道了几种新的粘附分子高度表达在MM-LDL处理的HUVEC膜表面及冠状动脉硬化内膜，特异性地诱导MC与VEC粘附6，8。亦有人提出纤维连接蛋白可能在其中起作用9。    基金项目

33、国家自然科学基金重点项目资助(39730220)    Tel：27307941-3140    参考文献    1Sakai A, Kume N, Nishi E, et al. P-selectin and vascular cell adhesion molecule-1 are focally expression in aortas of hyper cholesterolemic rabbits before intimal accumulation of mac

34、rophages and T lymphocytesJ. Arterioscler Thromb Vasc Bio, 1997, 17:310-316.    2Avogaro P, Gazzolato G, Bittolo-Bon G, et al. Some questions concerning a small, more electronegative low density liporprotein circulating in human plasmaJ. Atherosclerosis, 1991, 91:163-171. &#

35、160;  3Jaffe EA, Nochman RL, Becker CG, et al. Culture of human endothelial cells from umbilical veins: Identification by morphologic and immunologic criteriaJ. J Clin Invest, 1973, 52:1745-1758.    4Kosuqi k, Morel DW, Drcorleto PE, et al. Toxicity of oxidized LDL to cultured fibroblasts is selective for S phase of the cell typeJ. J cell physical