固定化酶课件

1、固定化酶固定化酶固定化酶深圳大学吴海强固定化酶一、概述生物催化剂作用方式示意固定化酶的发展史生物催化剂生物催化剂细胞细胞酶酶非生长非生长生长生长可溶可溶固定化固定化悬浮悬浮固定化固定化连续连续间歇间歇吸附吸附包埋包埋交联交联化学连续化学连续材料材料膜固定膜固定酶液酶液凝胶凝胶吸附吸附化学连接物化学连接物固定化固定化再循环系统再循环系统凝胶凝胶吸附吸附连续连续半连续半连续分批分批间歇间歇 连续连续活塞模式活塞模式搅拌连续反应器搅拌连续反应器间歇间歇连续连续活塞模式活塞模式搅拌连续反应器搅拌连续反应器固定化酶什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体酶自身载体酶自身载

2、体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术固定化酶化学偶联酶酶固定化固定化间歇间歇可溶可溶交联包埋吸附间歇间歇连续连续固定化酶固定化酶的优缺点v 可重复使用 v 可以装塔连续反应v优点： 纯化简单，易与产物分离v 提高产物质量v 应用范围广v 固定化过程中酶易失活v缺点： 首次投入成本高v 大分子底物较困难固定化酶二、固定化酶的性质及其影响因素（一）固定化酶的性质（二）固定化酶性质改变的原因（三）评价固定化酶的指标（四）固定化酶的活力测定方法固定化酶（一）固定化酶的性质v1 固定化对酶活性的影响： 酶活性下降，反应速度下降。v原因：酶结构的变化 空间位阻固定化酶2 固定

3、化对酶稳定性的影响v（1） 操作稳定性提高；v（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高；v（3） 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低；v（4） 对分解酶的稳定性提高；v（5） 对变性剂的耐受力升高。固定化酶固定化酶稳定性提高的原因：va. 固定化后酶分子与载体多点连接。vb.抑制自降解，提高了酶稳定性。vc.酶活力的释放是缓慢的。固定化酶3 最适pH的变化pH对酶活性的影响：v（1） 改变酶的空间构象v（2）影响酶的催化基团的解离v（3）影响酶的结合基团的解离v（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。固定化酶载体对固定化酶体系pH的影响v载体带负电荷，pH向碱性方向移动。

4、 微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。v载体带正电荷，pH向酸性方向移动。固定化酶产物性质对固定化酶体系pH的影响v催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低固定化酶4 最适温度变化v一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。 5 底物特异性变化v作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化v既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。固定化酶6米氏常数Km的变化Km值随载体性质的变化而变化v载体与底物带相同电荷，静电排斥，固定化酶降低了酶的亲和力，KmKm 。v载体与底物电荷相反，静电吸引，固定化酶增加了酶的亲和力，KmKm

5、。固定化酶（二） 固定化酶性质改变的原因1 酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。固定化酶2 载体的影响v（1） 分配效应v（2） 空间障碍效应v（3） 扩散限制效应3. 固定化方法的影响固定化酶（三）评价固定化酶的指标：游离酶v1.酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。v1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/minv =6*106IUv2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位 固定化酶固定化酶的指标：v1. 固定化酶的比活：每（克）干固

6、定化酶所具有的酶活力单位。v或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。v2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）固定化酶v3. v4. v或称偶联效率，活力保留百分数。v5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力固定化酶（四）固定化酶的活力测定方法v1. 振荡测定法：v2. 酶柱测定法：v3. 连续测定法 利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。固定化酶三、酶固定化技术三、酶固定化技术n 微型胶囊法n 吸附法n 胶格

7、包埋法n 共价交联法n 共价偶联法固定化酶1、微型胶囊法v是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。 固定化酶微型胶囊法制备固定化酶有两种方法v 界面沉淀法v这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。固定化酶界面聚合法v是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。固定化酶2、吸附法I 物理吸附法 静止法 电沉积法 反应器上直接吸附法 混合浴或振荡浴吸附法固定化酶优点：固定化时酶分子的构象很少或基本不发生变化。缺点：结合力弱

8、，易解吸附。载体：纤维素、琼脂糖、活性炭、沸石及硅胶等。固定化酶 II 离子结合法离子结合法 酶分子与与含有离子交换基团的固相载体相结合 第一个离子结合法固定化酶： DEAE Cellulose 固定化过氧化氢酶 第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶固定化酶3、胶格包埋法首先被采用的胶格包埋法是： 固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 淀粉酶Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺引发剂inactiation将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。固定化酶4、共价交联法5、共价偶联法可以形成共价

9、键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体固定化酶共价键结合法制备固定化酶的“通式”v载体上引进活泼基团v活化该活泼基团v此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键固定化酶载体活化的方法vA重氮法vB叠氮法vC烷基化反应法vD硅烷化法vE溴化氰法固定化酶A重氮法v反应示意式如下 固定化酶A重氮法v目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等v该方法需要载体具有芳香族氨基固定化酶A重氮法v反应式及原理固定化酶B 叠氮法v例v用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备

10、固定化胰蛋白酶，步骤如下：v 酯化v 肼解v 叠氮化v(4) 偶联固定化酶B 叠氮法v对含有羧机基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联 固定化酶C烷基化反应法v含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。固定化酶D硅烷化法v一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。v多孔玻璃特点：v机械强度好，表面积大。v耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。 固定化酶D硅烷化法固定化酶D硅烷化法固定化酶D硅烷化法固定化酶E 溴化氰法v本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的

11、占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。固定化酶E 溴化氰法固定化酶双功能试剂：双功能试剂：常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶交联的固定化酶4、共价交联法、共价交联法借助双功能试剂使酶分子之间酶分子之间发生交联交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。固定化酶常用于固定化酶的交联剂 交联剂戊二醛二重氮联苯胺2，2二磺酸4，4二氟3，3二硝基二

12、苯砜二苯基4，4二硫氰酸2，2二磺酸 1，5二氟2，4二硝基苯 酚2，4二磺酰氯 3甲氧基二苯基甲烷4，4二异氰酸盐 固定化酶酶共价交联有2种形式： 酶直接交联法 酶辅助蛋白交联固定化酶酶直接交联v在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度浓度、溶液pH和离子离子强度强度、温度温度和反应时间时间之间的平衡。固定化酶酶辅助蛋白交联v为避免避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶酶失活失活，可使用第二个载体蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。固定化酶酶共价交链法的操作方法：v（1） 吸附交联法v（2） 交

13、联包埋法固定化酶（1） 吸附交联法v先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。v用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶壳状固定化酶。固定化酶（2）交联包埋法v把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。v这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。固定化酶5、共价偶联法固定化酶固定化酶固定化酶固定化酶固定化酶图 711 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成

14、水不溶性的固定化酶固定化酶固定化酶方法研究热点v1 热处理法：v 2 结晶法：v 3 分散法：固定化酶固定化方法的另一种分类关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。四大类方法：v吸附法（包括电吸附法）v结合法（无机多孔材料）v交联法（双功能试剂） v包埋法（微胶囊法） 固定化酶各类固定化方法的特点比较: 比较项目比较项目吸附法吸附法结合法结合法 交联法交联法包埋法包埋法物理吸附物理吸附.共价键结合共价键结合离子键结合离子键结合 制备难易制备难易易易难难易易 较难较难较难较难固定化程度固定化程度弱弱强强中等中等 强强强强活力回收率活力回收率较高较高低低高高 中等中等高高载体

15、再生载体再生可能可能不可能不可能可能可能 不可能不可能不可能不可能费用费用低低高高低低 中等中等低低底物专一性底物专一性不变不变可变可变不变不变 可变可变不变不变适用性适用性酶源多酶源多较广较广广泛广泛 较广较广小分子底小分子底物、药用物、药用酶酶固定化酶酶固定化方法选择依据： v（1） 酶的性质v（2） 载体的性质v（3） 制备方法的选择固定化酶四、辅酶固定化原因v有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与参与酶的催化催化反应反应v有机辅因子在使用过程中要流失流失，并且不能自行再生不能自行再生v有机辅因子价格昂贵昂贵 工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生固定化酶辅酶固定化的方法：v固定

16、化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。v辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。 固定化酶辅酶的固定化固定化酶辅酶的固定化固定化酶辅酶固定化的形式：固定化酶五、固定化酶的应用乙酰乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酸乙酰乙酰 -D AlaAminoacylase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶1、固定化酶在工业生产上的应用、固定化酶在工业生产上的应用固定化酶泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala固定化酶2、固定化酶在医

17、学上的应用（酶电极）（1）葡萄糖电极半透膜酶胶层感应电极酶电极示意图D葡萄糖O2 D葡萄糖酸1，5内酯H2O固定化酶葡萄糖醌H2O葡萄糖酸氢醌葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶氢醌 醌2H2ePt铂电极固定化酶（2）脲电极Urea + 2H2O 2NH4+2HCO3-脲酶产生的2NH4+为阳离子电极感应。此外还有：氨基酸电极醇电极尿酸电极乳酸电极青霉素电极亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH3固定化酶酶电极v特点：快速、方便、灵敏、精确v范围：糖类、抗生素、氨基酸、甾体化合物、有机酸、脂粉、醇类、胺类以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等v要求：酶必须有较强的专一性，并且要有一定的纯度。固定化酶3、固定化酶在

18、基础研究中的应用Creatine Kinase肌酸激酶（肌酸激酶（MW 82000， Dimer）衍生物衍生物 C衍生物衍生物 BGdnHCl去除去除GdnHCl衍生物衍生物 A固定化酶表73 固定化肌酸激酶及固定化亚基的蛋白质含量及比活力酶的衍生物蛋白质含量比活力 （g/ml 凝胶）（） （单位/mg)衍生物A400 10028.0衍生物B210 52.525.7衍生物C380 95.027.4固定化酶4、 固定化酶在药物上的应用v例1v固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就可以生成不同的产物。固定化酶青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素OH2NR2R1NH2NSOOOHNR1NH2NSOOOOHH1: D-(-)-PGA (R1 = H, R2 = NH2)2: D-(-)-PGM (RI = H, R2 = OM e)3. D-(-)-HPGA (R1 = OH, R2 = NH2)4: D-(-)-HPGM (R1 = H, R2