碱性蛋白酶制备水牛乳抗氧化活性肽酶解条件的优化

1、碱性蛋白酶制备水牛乳抗氧化活性肽酶解条件的优化李玲,唐艳,农皓如，林波，曾庆坤(中国农业科学院 广西水牛研究所，南宁530001)摘 要：采用碱性蛋白 酶，以水解度以及DPPH自由基清除率为评价指标，通过单因素以 及正交实验优化 水牛乳蛋白的酶解工艺，确疋碱性蛋白酶制备水牛乳抗氧化活性肽的最佳酶解工艺为：底物质量分数5%,加酶量10 000 U/g,酶解pH值为10.5,酶解时间25 h，温度为60 C；此时，酶解物水解度 达30.46%±0.15%,DPPH自由基清除率 达69.13%±1.22%。中图词：碱性蛋Q936水+牛乳；抗氧化活性:;多肽；酶解文章编号：1001

2、- 2230(2011)12- 0012- 03Optimizing enzymolysi s condition s of antioxidant activity buffalo milk peptide with alkaline proteaseLI Li ng, TANG Yan , NONG Hao- ru , LIN Bo , ZENG Qin g- k un(Gu angxi Buffalo Re search I nstitute, Ch inese Ac ademy of Agricultural Sciences, Na nn ing 530001, Ch ina)Abs

3、tract:The buffalo milk peptide was preparedwith alkaline protease, enzymolysisconditions was optimized by single- factor and orthogonal tests,which were evaluatedby the hydrolysis degree and DPPH scavenging rate ,the result snows that : the optimun conditions are: concentra tion of substrate 5%, enz

4、yme addition 10 000 U/g substrate, enzymolysis pH10.5, enzymolysistime 2.5 h, enzymolysis temperature60 °C , In this process the hydrolysis degree and DPPHscavenging rate reach 30.46%t0.15% and 69.13%±1.22%.Key words: alkaline protease; buffalo milk; antioxidative activity;peptide; enzymol

5、ysiconditions0引言乳源肽具有较强的生物活性，能起到抗氧化、抗菌、抗病毒、抗高血压、抗血栓、提高免疫力等作用，具有极高的开发利用价值1,水牛奶乳汁浓厚，品质优 良，是制作各种高档乳制品的良好原料。采用碱性蛋白酶酶解水牛乳蛋白，以水解度以及DPPH自由基除率为评价指标，通过单因素以及正交实验优化酶解工艺，以促进水牛乳蛋白肽的开发利用。1 材料与方法1.1 材料水牛乳；碱性蛋白酶；DPPH ;其余试剂为分 析纯。 乳成分分析仪；pH计；HH -4数显恒温水浴锅 ；紫外 分光2光 度方T法; Alph a 1 -2 LD真空冷冻干燥机。1)水解度的计算采用pH- Stat 2】滴定法。收

6、稿日期：2011- 08- 15基金项目：水牛基(1007007。作者简介：李玲(1984-)，女，硕士，研究方向为食品科学与技术 通讯作者：曾庆坤2 )DPPH 清除率的计算。参考Saiga A【)酶解工艺。水牛乳T孚L脂分离机脱脂乳(乳脂含量0.5%水牛乳质量)T HCl调pH值至4.6蛋白T过滤，弃滤液T酪蛋白加少量蒸馏水清洗多次至上清液无色t用 浓度为0.05 mol/ L的NaOH 溶液在一定温度下溶解酪蛋白t完全溶解后t加蒸馏水 调至实验所需酪蛋白底物质量分数，并调pH值至 酶解所需条件T取水牛乳酪蛋白溶液T加适量酶T 在一定条件下进行酶解T反应中持续滴加浓度为 0.5 mol/

7、L的Na OH溶液维持反应体系pH值，并记录 水解液所需碱液体积，计算水解度T水解完成后T沸-水中灭酶5 min t快速冷却至室温t调节溶液pH值】等人的 方法，配置0.1 mm ol/ LDPPH 无水乙醇溶液，测定加 样方法如表1所示，加样后充分震荡混匀，室温下反 应30 min，在517 nm 下测定吸光度值。清除率=1- A1-A2)/A° X1 00%。表1 DPPH自由基清除率测定加样方法程序加样A01.5 mL DPPH无水乙醇溶液0.1 mmol/ L )+1.5 mL样品的溶剂Ai 1.5 mL DPPH 无水乙醇溶液 0.1 mmol/ L) +1.5 mL 样品

8、 A21.5mL无水乙醇溶液+1.5 mL样品122 011年第39卷第12期总第253期)外源酶底物质量分数/%酶解PH加酶量e/S U/g底物）时间温度/C碱性蛋白酶5%/h10.58 0003.555表2单因素实验条件化不显著；底物质量分数为9%时，反应液质量 分数过高，底物的溶解差，黏度增加，抑制蛋白 质与酶的结合，水解度迅速下降质量分数有利于酶解反应进行4.6, 4 200 r/ min离心，去除未被水解的酪蛋白 清液，调节pH值至6.8，冷冻干燥得4）单因素实验。以蛋白酶解物的水解度及清除率为评价指标，对酶解工艺中的底物质量分数酶解pH、加酶量、酶解时间以及温度进行单因素实验在测定

9、某一因素的最佳条 件时，固定其他单因素的条件不变，单因素实验条件如表2所示。5）正交实验。在单因素实验的基础上，以加酶量、酶解pH值、时间和温度作为试验因子 素三水平正交设计对酶解条件进行优化肽 制备的最佳工艺DPPH，采用四因，以得到蛋白2 结果与讨论2.1 单因素实验以蛋白酶解物的水解度及自由基清除率为评价指标酶解物，对酶解工艺中的底物质量分30 mg / mL数、酶解pH、加酶量、酶解时间和温度进行单因素实验2.1.1 pH值对酶解的影响物质量分数又造成溶解度降低，影响蛋解反应有抑制作用，在保证较高水解度量分数选择 5%。加酶量对酶解的影响5。因此，高底物，但同时过高底白酶扩散，对水情况

10、下，底物质1川7(1航04(1图2 底物质量分数对水解度庫、DPPH清除率的影响JI.pHf|时贰If Nt H pH(fi efl-PPlh：¥卄70 ,同XIII >20 q1()0为确定最适加酶量，采用加酶量2 000,4 000 , 6 000 ,8 000,1 0000,12 000U/g 底物）进 行对比实验， 结果如图3所示。由图3可以看出，随着加酶量的增 加，水解度逐渐增大，加酶量大于6 000U/g 后水解度增速逐渐减小。底物的水解度取决于蛋白酶的量，但当酶分子在体系中趋于饱和后，部分酶 不能和底 物接触时，水解度的提高会减慢6 。DPPH清除率在到达 增加至

11、12 000U/g时，水解度仅增加0.91%。综合考虑 成本因素，确定最宜加酶量为6 0001 0000 U/g 底物K1in图1 pH值对水解度、DPPH清除率的影响每一种酶都有其最适反应 pH的变化比较敏感pH值，酶对反应体系7D Ml0 L_1lM)Q"d(Hl iunn I uukh Ah IUu 値 I化表现出不同的解离状态 白的结合与催化活力 条件选择pH值为 果如图1所示。，蛋白酶以及底物的 ，pH值。为确定酶解的蛋白随着pH的变 直接影响酶与底物蛋最适pH值，酶解图3 加酶量对水解度毎、DPPH清除率的影响8.5,9.0,9.5，0.0，0.5,11.0 ? 11.5

12、，结 由图1可以看出，水解度在pH值为时）.水时达度到3最4%傅PP冷6清除率达到最大除率为56.58%，朔 76.74%。 解反应的最物质量分数对酶解的影猗你0。为确定最适底物质量分数，采用底物质量2% ,3% ,5% , 7%, 9%进行对比实验，结果如图2 图2可以看出，底物质量分数为 2%时，DPPH 低； 底物质量分数在3%以上，水解度以及DPPH分数为所示。由清除率清除率时间对酶解的影响为确定最适酶解时间，采用酶解时间0.5,1.0,1.5 ,2.0,2.5,3.0,3.5 h进行对比实验，结果如图4所示。由 图渐增大，在3.0 h时达到最大蛋白酶对蛋白质进7行8逐步水解，首先被水

13、解为较小的具有一定活性的肽段，随着水解的进行，活性肽段又进一步过度水解 为氨基酸，致部分活性消失，同时随着反应的进行，底物质量分数降低，产物的大量增加，抑制了反应的进Vol.39，No.12 2011(total 253)1 3$94-2013 China AcEideciip Jounial Elaclionic Publishing House. All f辿肌用迪*弋山 hUp:ww.CnkbllHABCD水平加酶量e/S U/g底物）酶解pH值时间/h温度/ C16000值 10.02.5502800010.53.05531000011.03.560表3 L9（34）正交实验因素水平i

14、o0 1 （ID O.S 10 15 30 3.53.5 4 D时何中韵 n| iJ * WQ 旳 I； t-l U'j nl Jf'j'D Tli* 叶* 的:;：4'J團图4卜ii水解时间对水解度.|、|DP.PH.清除率的影响行"1,3.0 h后，水解度及DPPH清除率变化小。最适宜 酶2%时间温度对酶解的影响1。为确定最适酶解温度，采用温度为40 ,45 ,50,55 ,60 , 65 °C进行对比实验，结果如图5所示。由图5可 以看出，40 -55 C随着温度升高水解度及DPPH清除 率逐渐增大，原因是低温下酶的稳定性高 ，但酶活低

15、，随着温度的升高，酶活力增加，反应物之间的分子间有 效接触的频率增加。酶催化反应在其最适温度下，酶反应速度达到最大值。55 C后随着温度的不断升高，碱性蛋白酶逐渐失活，酶解反应出现了停滞现象，水解度和D PPH清除率不再增大55 C条件下水解度和DPPH清 除率分别达到最大值为28.91%和84.7 9% ,最A因素BCD水解度/% DPPH清除率/%1111121.7331.462122227.8350.663133334.1766.354212326.4243.915223130.6540.996231219.6176.27731333.4735.508321333.1269.119332

16、130.8966.58水k127.9127.2124.8227.76T=257.89T=480.83解k225.5630.5328.3826.97度k332.4928.2232.7631.24/%R6.933.337.944.27清k1494936.9658.9546.35除k253.7253.5953.7254.15率k357.0669.7347.625979/%r7.5732.7811.331344表4 L9（3）正交实验结果分析y* 20匕10量 > 温度沖H值，得到的最优条件为A 3B 2C 3D 3。由 D PPH清除率作为指标得到的极差值分析，因素的主次顺序依次为pH值 &g

17、t; 温度 > 时间 > 加酶量，pH值为 11.0时，虽然D PPH自由基清除率较高，但通过方差 分析多重比较显示,与pH值为10.5条件下D PPH自由基清除率无显著差异P>0.05 ），且酶解底物中残留微量35 II） 45505565 70謀唯V : 'j r un r -:矗图5 温度对水解度、DPPH清除率的影响综合上述单因素实验结果，得到酶解酪蛋白的单因素最 佳条件:pH值为10.011 .0，底物质量分数为加%酶量为6 00010 000 U/g ,酶解时间为2.53.5 h ,温 度为 5060 C。2.2 正交实验通过单因素实验得 到水牛 乳蛋 白

18、的最佳 酶解条 件:pH值为10 .011.0 ,底物质量分数为5%，加酶量为6 00010000 U/g，酶解时 间为 2.53.5 h，温度为 50 60 C。设计四因素三水平正交实验对最佳酶解条件进行优化，以水解度以及质量浓度为20g/L 酶解物DPPH清除率为评价指标。正交因素水平如表3所正交实验结果如表4所示，由水解度作为指标得到的极差值分析，因素的主次顺序依次为时间 > 加酶的乳糖，在强碱性以及加热条件下发生颜色反应，残影响DPPH 自由基清除率的测可能导致清除率的丿、, . . . .分析结果与真实结果有一定偏差,因为DPPH反应测定时颜色是由紫色变为黄色。因此，由DPPH

19、自由基清除率PPff的最优条件为除率并A结否操作综合考虑济解度以等考 虑得到最佳组合A3B2C1D3，即酶解pH值为10.5，加酶量为310验0证实/g佥，时间为2.5 h，温度为60 C。对正交实验结果进行3次验证实验。验证实验得到酶解水解度为30.4 6%±0.15% ,质量浓度为20 g/L的DPPH，清除率为 69.13% ±1.22%。3 结论以水牛乳为原料，选择碱性蛋白酶对水牛乳蛋白 进行酶解实验，利用单因素实验以及正交实验，得到 水牛乳蛋白肽的最佳酶解条件为：底物质量分数5%、加酶量10 000 U/g底物、酶解pH值为 下转第19页）142011年第39卷第

20、12期 总第253期）©China AcadMiiic Joiifiial f electronic Piiblishioi?, Elcuse. All rig his reserved. liHp:. enki Jid醛、双乙酰、挥发酸、酸类物质等)与风味指标风味强 度和风味协调性)综合分析，运用数学手段分析风味 物质与风味指标之间的关系，结果如表7所示。表7不同储存温度下发酵乳中风味物质与风味品评分数的相关系数相关系数乙醛双乙酰挥发酸酸度风味强度风味协调性乙醛10.3650.82旷0.728*0.456-0.666*双乙酰-10.722*0.831*0.441-0.242挥发酸-

21、10.860*0.495*-0.487*酸度-10.510*-0.420风味强度-1-0.038风味协调性-1由表7可以看除了乙醛和双乙酰之间的相关关系出发酵乳中风味物质乙醛、双乙酰、挥发酸以及酸性物质两两相关显著。发酵乳中的挥发酸和酸性物质与风味强度均在a=0.05 水平上显著相关，其中发酵乳 中的乙醛与风味协调性相关非常显著 (相关系数为-0.666 )，挥发酸与风味协调性相关显著(相关系数为-0.487 )。由此可见，发酵乳中各风味物质，包括羰基化合物、挥发酸以及酸类物质，对发酵乳的风味协调性 和风味强度均有不同程度的影响。发酵乳的风味，是由各种主要风味物质共同组成的一个复杂的整体。3

22、结束语本研究 通过对储存在不同温度、不同时间下的成品发酵乳的风味物质及风味指标进行研究，揭示了冷藏条件下成品发酵乳中风味物质的变化规律，以 及发酵乳风味感官变化 情况。通过数 据分析，得到发酵乳风味物质之间及其与风味指标的相关关系规律，对发酵乳风味研究有理论和实践上的积极作用。由于食品风味化学涉及的化合物种类繁多，各 种物质风味特性也不尽相同。在其后的研究中，可以通过增加样品种类和数量、扩大风味物质研究种类、以及运用更适合的数学分析工具对发酵乳的风味化学 进行更为深入的分析，深入揭示发酵乳风味物质与风味之间的复杂关系。参考文献：1 郭本恒.酸奶M.北京:化学工业出版社，2003:18&

23、1952 梅林,王志耕.酸奶、乳酸菌饮料风味及其 部分理化特性的 研究J.乳 业科学与技术,2004, 106(1): 17- 19.3 OTT A, HUGL A, BAUMGARTNER M, et al. Sensorylnvestigstion of Yogurt Flavor Perception: Mutual Influence of Volatiles and Acidity J. J. Agric. FoodChem., 200C(48): 441- 450.4 LO C G, LEE K D, RICHTER L, et al. Influence of Guar Gum

24、on the Distribution of some Flavor Compounds in Acidified Milk Prod- uctsJ. J. DairySci., 1996 79: 2081- 2090.5 李锋，华欲飞.大豆酸奶的风味物质研究J.中国乳品工业,200432 (12):19- 21.6 MARCH E H. Applied Dairy Microbiology M. New York: Marcel Dekker Inc., 1998：231- 2337 GB541334- 2010食品安全国家标准-乳和乳制品酸度的测定S.8 杨具田.发酵乳风味的产生与控制(下

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