survivin反义寡核苷酸诱导胃癌原代细胞凋亡的实验研究

1、survivin 反义寡核苷酸诱导胃癌原代细胞凋亡的实验研究【摘要】 目的 探讨survivin反义寡核苷酸对人胃癌原代细胞凋亡的影响，为胃癌的靶向治疗提供实验依据。方法 利用人胃癌实体瘤新鲜标本培养胃癌原代细胞，胃癌细胞分为空白对照组、脂质体组、正义寡核苷酸组及反义寡核苷酸转染组。用脂质体介导survivin 反义寡核苷酸转染胃癌原代细胞，48 h后，观察肿瘤细胞的形态变化，Western blot检测survivin蛋白的表达，流式细胞术检测细胞的凋亡。结果 反义寡核苷酸转染组肿瘤细胞体积变小，细胞碎裂，出现凋亡小体；survivin蛋白量下降；流式细胞术检测到肿瘤细胞的凋亡率增高。与其他

2、各组相比，其差异有统计学意义（P<0.05），而空白对照组、脂质体组、正义寡核苷酸组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。结论 survivin反义寡核苷酸在脂质体介导下转染人胃癌原代细胞，可以诱导肿瘤细胞发生凋亡，抑制细胞生长，反义survivin可能成为一个促进胃癌细胞凋亡的手段。 【关键词】 survivin；反义寡核苷酸；凋亡；原代细胞；胃癌 Research on effects of survivin antisense oligonucleotide inducing apoptosis of primary cell of human gastri

3、c carcinoma Abstract Objective To investigate the effects of survivin antisense oligonucleotide on inducing apoptosis of primary cell of gastric carcinoma and provide the evidence in experiment for the targeting therapy of gastric carcinoma.Methods The primary cells were cultured with the fresh tiss

4、ue from human gastric carcinoma.The cultured primary cells were collected and divided into four groups:sham control group，liposomes control group，SODN control group and ASODN experiment group.After transfecting cells for 48 hours using synthesized survivin ASODN by liposome，cultured cell were harves

5、ted to carry out next tests:primary cell morphological changes were observed by the inverted microscope，survivin protein expression was detected by Western blot，cell apoptosis was examined by flow cytometry.Results Primary cells were transfected after 48 hours，abnormal morphological change of primar

6、y cell was observed in ASODN transfected group.The expression of survivin protein in ASODN group was decreased as compared with other control groups by Western blot detection.The flow cytometry showed the AR of ASODN group was significantly higher than that of other groups.There were statistical dif

7、ferences between ASODN group and the other groups （P<0.05），and no differences among sham group，lipsome group and lip-SODN group（P>0.05）.Conclusion Survivin antisense oligonucleotide can induce the apoptosis and inhibit the growth of the primary cell of gastric carcinoma.Survivin ASDON

8、might be a method to promote the apoptosis of the cell of gastric carcinoma. Key words survivin;antisense oligonucleotide; apoptosis; primary cell; gastric carcinoma 胃癌是一种严重危害我国人民健康的常见病，寻找有效的治疗方法已成为日益紧迫且严峻的问题。目前治疗胃癌的主要手段是以手术、化疗为主，辅以放射治疗、中药、免疫治疗等手段1，但上述方法均有其一定的局限性，这些方法的单独或联合应用并没有使胃癌患者的整体存活率得到明显提高。由此，

9、治疗肿瘤开始向靶向治疗方向发展2，靶向治疗的前提就是要寻找分子标靶。survivin是一个理想的分子标靶3，它通过直接或间接抑制caspase-3、7而实现其抗凋亡功能4，还具有调节细胞增殖，参与新生血管形成等作用。针对survivin这个新靶点，研制出来反义survivin。许多研究已经证实survivin反义寡核苷酸（ASODN）能够诱导胃癌SGC-790157细胞的凋亡，而在胃癌原代细胞中少见有报道。本实验利用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染胃癌原代细胞，探讨survivin反义寡核苷酸对胃癌细胞的凋亡诱导作用。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 胃癌实体瘤 从医院手术

10、室内取胃癌实体瘤标本，经适当处理后进行胃癌细胞的原代培养。 1.1.2 试剂 胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品，RPMI 1640 购于Invitriogen 公司。脂质体JetPEITM转染试剂为PolyPlus-transfection 公司产品。survivin 反义寡核苷酸（ASODN） 序列: 5> CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG <3survivin；正义寡核苷酸（SODN） 序列:5> CAAGGAGCTGGAAGGCTGGG<3 两链所有碱基全硫代修饰，均为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。细胞处

11、理试剂盒由上海昂佰生物医学科技有限公司生产。 1.2 方法 1.2.1 胃癌原代细胞的培养 在医院手术室取胃癌新鲜标本，无菌操作，取肿瘤组织块，用含青、链霉素及两性霉素B的D-Hanks 20 ml浸泡后，切成1 mm×1 mm×1 mm大小组织块，放入鼠尾胶原包被的培养瓶内，组织块间距约0.5 cm，加培养液至组织块底部刚好没入液面下。培养瓶放入37 含5%CO2培养箱内。24 h换液1次，直至细胞长出多量后，加入常规量培养液。培养细胞呈半贴壁生长，传代时直接从一培养瓶内转移入另一培养瓶内继续培养，培养至第3代时，收集细胞，取广义原代细胞概念（10代内），对培养至第3代的

12、胃癌细胞进行实验操作。 1.2.2 细胞分组及转染 收集培养至第3代处于生长对数期的肿瘤细胞，接种于24孔板，分为4组：空白对照组，脂质体组，正义寡核苷酸组，反义寡核苷酸转染组。用JetPEITM脂质体作为转染介导物。各注意事项均按说明书进行，以保证最大的转染率。空白对照组加入生理盐水，脂质体组仅加入脂质体，正义寡核苷酸组及反义转染组加入脂质体及寡核苷酸链复合物。细胞量及液体量按JetPEITM说明书推荐的量进行操作，脂质体及寡核苷酸浓度的配制亦均按说明书用生理盐水稀释。24 h和（或）48 h后，收集各组细胞进行后续实验。 1.2.3 Western blot 检测survivin蛋白 转染

13、48 h后，离心收集各组细胞，用冰冷的PBS洗涤3次，尽量吸掉残余的PBS，将预冷至4 的细胞裂解液加入至洗涤的细胞中（每20 l细胞沉淀中加入200 l 细胞裂解液），离心（13000 rpm，5 min），取上清，在紫外分光光度仪中检测样品中蛋白含量（按Lowry 等方法，以牛血清白蛋白为标准蛋白）。以100 g/孔上样，经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，以湿转法电转移至NC膜上。将NC膜置于封闭液中，室温孵育3 h后，加入一抗（兔抗人survivin 抗体，稀释度1500），4 孵育过夜，TBST充分漂洗（5 min×3次），加入AP标记的二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG

14、-AP，稀释度1500），37 作用2 h，TBST充分漂洗（5 min×3次），以NBT/BCIP显色，流水洗涤终止反应。结果用图像分析仪（Gene Company）分析处理。 1.2.4 流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡 收集转染24 h和48 h的反义寡核苷酸实验组及其他三组细胞，进行流式细胞术实验。收集细胞数达2×106细胞/ml，离心去上清，沿管壁缓慢加入70%冰乙醇1 ml，边加边摇动，使细胞悬浮固定，向管内加入PI染液400 l，04 避光保存并染色30 min，上机检测肿瘤细胞凋亡。 1.3 统计学方法 数据以均数±标准差（±s）表示，采用统

15、计软件Stata 8.0进行单因素方差分析（ANOVA）及Scheffe法分析组间差异，P<0.05为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 形态的改变 survivin ASODN 作用后的胃癌原代细胞表现为体积变小，细胞皱缩，核固缩，胞浆粗糙，细胞数量减少。而空白对照组，脂质体组，正义链组的细胞生长状况无明显差异，细胞生长较活跃，细胞数量未见明显减少，细胞透明度大，折光性强（图1）。 2.2 Western blot 检测肿瘤细胞survivin蛋白的表达变化 survivin反义寡核苷酸转染细胞48 h后，survivin蛋白表达下降，而空白对照组、脂质体组、正义寡核苷酸组

16、survivin蛋白表达无明显变化。反义寡核苷酸转染组与其他组之间蛋白表达的差异有统计学意义（P<0.05），而其他三组之间蛋白表达的差异无统计学意义（P>0.05）。各组蛋白条带灰度比值，见表1。表1 转染48 h survivin蛋白条带灰度注：Lip-ASODN与其他各组比较，*P<0.05 2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 转染24 h和48 h后，收集survivin-ASODN转染组的肿瘤细胞以及其他三组细胞进行流式细胞仪检测，细胞凋亡率以48 h后变化较为明显。survivin-ASODN转染实验组凋亡率（AR）高于各对照组（P&

17、lt;0.05），而各对照组间凋亡率的差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。表2 转染24 h和48 h后，各组细胞 凋亡率注：Lip-ASODN与其他各组比较，*P<0.05 3 讨论 survivin是 IAP （inhibitor of apoptosis protein）家族中的一个新成员，它是由Altieri等8在1997年发现的。survivin蛋白是一种凋亡抑制因子，主要表达于细胞周期的G2/M期9。它过多表达于绝大多数常见的恶性肿瘤如肺癌10、乳腺癌11、结肠癌12、胃癌13、霍奇金病14，以及大约50%的非霍奇金淋巴瘤8等组织中，而在这些肿瘤中

18、相对应的正常组织不表达survivin。survivin 具有理想的分子标靶应有的所有特点3 。反义survivin是利用反义技术设计合成的，它是以survivin基因（或survivin mRNA）为靶，并与之特异性互补结合的一段由1520个核苷酸组成的人工合成寡核苷酸。survivin 反义寡核苷酸与survivin mRNA作用，使survivin蛋白表达下降，继而其凋亡抑制功能降低，促进了肿瘤细胞的凋亡，从而达到治疗癌症的目的。 本实验为了探讨survivin反义寡核苷酸对胃癌细胞凋亡的影响，选用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染胃癌原代细胞。脂质体介导的转染法是阳离子脂质体包

19、裹带阴电荷的DNA，以静电作用相结合，形成稳定的复合物，细胞通过内吞作用摄入胞质内。该方法操作简单，生物安全性好，细胞毒性极小，无抗原性，无污染，故易被接受。脂质体介导的反义核酸转染技术同其他基因治疗相比更贴近临床，是目前众多基因治疗方法中最有可能进入临床试验的一种。 实验中所用的survivin ASODN，是由20个核苷酸构成的短链。目前认为1520个碱基的反义寡核苷酸链可以有效的发挥作用。另一方面，survivin ASODN所有的碱基结构经过修饰，与传统药物相比，ASODN具有高特异性、低毒、安全，但在体内易被酶降解，在进入细胞前要对其进行结构修饰改造，以提高其稳定性16。本实验采用的

20、碱基全硫代磷酸修饰，其DNA片段磷上的羟基被巯基取代，形成的仍是带负电荷的大分子，理化和生物性质与正常DNA片段很相似，可以通过受体的作用完整地通过细胞膜进入细胞。修饰后的核苷酸链其抗核酸酶作用的能力很强，能与互补的核酸形成稳定的双链复合物，同时能激活RNase H，促进mRNA的降解17。 实验把原代细胞分成4组，即空白对照组、脂质体组、正义链组和survivin ASODN转染组。Western blot显示ASODN转染组survivin蛋白表达下降，而其他各组没有明显变化。流式细胞仪检测显示ASODN转染组其凋亡率增高。倒置显微镜下ASODN转染组细胞体积变小、细胞固缩、碎裂。上述实验

21、结果显示，survivin反义寡核苷酸作用于胃癌细胞后，survivin 的蛋白表达下降，细胞生长受到抑制。survivin反义寡核苷酸不但能够对胃癌细胞系产生影响，诱导细胞凋亡，抑制增殖，而且也能影响胃癌原代细胞的生长，诱导其凋亡。验证了 survivin是良好的抗肿瘤基因治疗靶点，为今后进行体内基因治疗的研究提供了一定的实验依据。【参考文献】 1 王绪，张敬川，朱广迎.肿瘤学基础与治疗总论.上海：第二军医大学出版社，2001，181-285.2 师英强.肿瘤靶向治疗的现状与进展.中国实用外科杂志，2006，26（6）：422-424.3 Hsieh RK.Molecular targete

22、d therapy for solid tumors.Formosan J Med，2003，7:222-226.4 OConnor DS，Grossman D，Plescia J，et al.Regulation of apoptosis an cell division by p34cdc2 phosphorylation of survivin.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（24）:13103-13107.5 马荣，陈曦海，张岂凡.反义Survivin核酸诱导凋亡及逆转胃癌耐药机制的实验研究.世界华人消化杂志，2006，14（12）：1139-1145.6

23、 刘超侠，孔庆兖.Survivin反义寡核苷酸对人胃癌细胞增殖的抑制作用.徐州医学院学报，2006，26（1）：46-48.7 王晓梅，王一平，董芸.生存素反义寡核苷酸对胃癌细胞株SGC-7901生长的影响.实用癌症杂志，2005，20（1）:24-27.8 Ambrosini G，Adida C，Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma.Nat Med，1997，3（8）:917-921.9 Bao R，Connolly DC，Murphy M，et al.Activati

24、on of cancer-specific gene expression by the survivin promoter.J National Cancer Institute，2002，94（7）：522-528.10 Monzo M，Rosell R，Felip E，et al.A novel anti-apoptosis gene:Re-expression of survivin messenger RNA as a prognosis marker in non-small-cell lung cancers.J Clin Oncol，1999，17（7）:2100-2104.11 Tanaka K，Iwamoto S，Gon G，et al.Expression of survivin and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas.Clin Cancer