仪器分析-HPLC课件

1、第三章第三章 高效液相色谱分析高效液相色谱分析 （HPLC） High Pertormance Liquid Chromatography3-1 3-1 高效液相色谱的特点与仪器高效液相色谱的特点与仪器一、一、HPLCHPLC定义定义 HPLCHPLC是指流动相是指流动相为液相的色谱技术。为液相的色谱技术。HPLCHPLC是是2020世纪世纪7070年年代发展起来的一项代发展起来的一项高效，快速分析技高效，快速分析技术。术。二、高效液相色谱法的特点二、高效液相色谱法的特点 特点：高压、高效、高速1 1、高压、高压 HPLCHPLC以液体为流动相，流经色谱柱时，阻力以液体为流动相，流经色谱柱时，

2、阻力较大，为了能迅速地通过色谱柱，需对液体加压较大，为了能迅速地通过色谱柱，需对液体加压力，压力很高，力，压力很高，一般可达一般可达15015035035010105 5PaPa，高，高压是压是HPLCHPLC的一个突出特点。的一个突出特点。2 2、高速、高速 HPLCHPLC液相色谱法所需的分析时间较之经典液液相色谱法所需的分析时间较之经典液体色谱法少得多，一般都小于体色谱法少得多，一般都小于1 1小时小时. . 如：如：对对氨基酸分析氨基酸分析，用经典液相色谱法，一般需要，用经典液相色谱法，一般需要2020多个小时多个小时，而，而HPLCHPLC法只需法只需1 1小时。小时。3 3、高效、

3、高效 GC:GC:柱效约为柱效约为20002000塔板塔板/ /米；米；HPLCHPLC柱效约为柱效约为3 3万塔板万塔板/ /米以上米以上。这是由于近年来研究出了许多新型固定相的结这是由于近年来研究出了许多新型固定相的结果（如化学键合固定相），使分离效率大大提高。果（如化学键合固定相），使分离效率大大提高。4、高灵敏度、高灵敏度 采用高灵敏度的检测器采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏，进一步提高了分析的灵敏度，如度，如UVUV检测器，（检测器，（1010-9-9g g）；荧光检测器（）；荧光检测器（1010-11-11g g）。）。由于由于HPLCHPLC的高灵敏度，分析所的高灵敏

4、度，分析所需试样很少需试样很少（L L级级）。GCGC与与HPLCHPLC应用范围的区别应用范围的区别 GCGC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测（占高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测（占有机物的有机物的20%20%） HPLCHPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对对分子量大、

5、高沸点、热稳定性差的生化样品及高分子分子量大、高沸点、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的，用途广泛，占有机物的80%80%。GCGC与与HPLCHPLC流动相差别流动相差别 GCGC：流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作力，流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作力，只与固定相有相互作用。只与固定相有相互作用。 HPLCHPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，

6、改变流动相极性和且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pHpH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。GCGC与与HPLCHPLC操作条件差别操作条件差别 GCGC：加温操作：加温操作 HPLCHPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）三、流程及主要部件三、流程及主要部件1.1.结构流程结构流程2、主要部件、主要部件（1）高压输液泵）高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：15015035035010

7、105 5 Pa Pa。为了高柱效而使用粒度很小的固定相（为了高柱效而使用粒度很小的固定相（10m10m），流动相高速通过时，将产生很高的压力；），流动相高速通过时，将产生很高的压力；高压、高速高压、高速是高效液相色谱的特点之一是高效液相色谱的特点之一。要求：压力平稳、脉冲波动小、流量稳定可调要求：压力平稳、脉冲波动小、流量稳定可调、耐腐蚀等、耐腐蚀等 高压泵按其性质可分为高压泵按其性质可分为恒流泵和恒压泵恒流泵和恒压泵。常用的两。常用的两种：种： a.a.往复式柱塞泵往复式柱塞泵恒流泵恒流泵 柱塞每分钟大约需往复运动柱塞每分钟大约需往复运动100100次。次。优 点优 点 ： 死 体 积 小

8、： 死 体 积 小（0.1mL），更换溶剂），更换溶剂方便，很适用于梯度洗方便，很适用于梯度洗提。提。缺点缺点：输出有脉冲波动，：输出有脉冲波动，干扰某些检测器工作，干扰某些检测器工作，产生基线噪声，影响检产生基线噪声，影响检测灵敏度。测灵敏度。（动画动画）b.b.气动放大泵气动放大泵- -恒压泵恒压泵 根据液体压力传导原理：根据液体压力传导原理： P P1 1S SA A=P=P2 2S SB B 设计设计。 （动画动画） 如果：如果：A:BA:B为为50:150:1；则压力为；则压力为5 510105 5 Pa Pa的液体就可的液体就可以得到压力为以得到压力为25025010105 5 P

9、a Pa的输出液体。的输出液体。优点优点：能供给无脉冲的、稳定流量的输出。：能供给无脉冲的、稳定流量的输出。缺点缺点：液缸体积大，更换流动相不方便，不适用于频：液缸体积大，更换流动相不方便，不适用于频繁更换流动相的实验，也不便于梯度洗提。繁更换流动相的实验，也不便于梯度洗提。（2） 梯度洗提装置梯度洗提装置 所谓梯度洗提，就是所谓梯度洗提，就是载液中含有两种（或更多）载液中含有两种（或更多）不同极性的溶剂不同极性的溶剂，在分离过程中，按一定的程序连续，在分离过程中，按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液极性的变化改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液极性的变化来改变被分离组分的分离

10、因素，以提高分离效果。来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。（3）进样装置）进样装置1.1.注射器进样装置注射器进样装置 缺点是不能承缺点是不能承受高压，在压力超过受高压，在压力超5PaPa后，后，由于密封垫的泄漏，带压进样实际成由于密封垫的泄漏，带压进样实际成为不可能。为不可能。2.2.高压定量进样阀高压定量进样阀 这是通过进样这是通过进样阀（通用六通阀）直接向压力系统阀（通用六通阀）直接向压力系统内进样而不必停止流动相流动的一内进样而不必停止流动相流动的一种进样装置。种进样装置。（4 4）色谱柱色谱柱 * *HPLCHPLC常用的标准柱是常用的标准柱是内径为

11、内径为4.64.6或或3.9mm3.9mm，长，长度为度为151530cm30cm的直行不锈钢柱的直行不锈钢柱。填料颗粒度。填料颗粒度5 51010m m，柱效以理论塔板数计大约，柱效以理论塔板数计大约500050002000020000。 * *HPLCHPLC发展的一个重要趋势是减小填料颗粒度发展的一个重要趋势是减小填料颗粒度（3 35um5um）和柱径（）和柱径（1mmRbRb+ + K K+ +NHNH4 4+ + Na Na+ +HH+ +LiLi+ +二价阳离子的二价阳离子的K KB/AB/A值顺序：值顺序： BaBa2+2+PbPb2+2+ Sr Sr2+2+CaCa2+2+ C

12、d Cd2+2+CuCu2+2+对于季铵型阴离子交换树脂，一价阴离子的对于季铵型阴离子交换树脂，一价阴离子的K KB/AB/A值顺序：值顺序： ClOClO4 4- - I I- - HSO HSO4 4- - SCN SCN- - NO NO3 3- - Br Br- - NO NO2 2- - CN CN- - Cl Cl- - BrOBrO3 3- - OH OH- - HCO HCO3 3- - H H2 2POPO4 4- - IO IO3 3- - CH CH3 3COOCOO- - F F- -ABRBARB/AK 五、离子色谱法五、离子色谱法 离子色谱法是分析水溶液中阴离子的最

13、佳离子色谱法是分析水溶液中阴离子的最佳LCLC方法。以方法。以离子交换树脂为固定相，电解质溶液为离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相流动相，电导检测器为通用检测器电导检测器为通用检测器。采用交换容量采用交换容量非常非常低的特制离子交换树脂为固定相；低的特制离子交换树脂为固定相；细颗粒柱填料，采用高压输液泵，高柱效；细颗粒柱填料，采用高压输液泵，高柱效；低浓度淋洗液低浓度淋洗液或或本底本底电导电导抑制抑制（在分离柱后，采用抑（在分离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）；制柱来消除淋洗液的高本底电导）；在线电导检测器，对离子高灵敏；在线电导检测器，对离子高灵敏；快速分离分析微量无机离子混

14、合物；快速分离分析微量无机离子混合物；各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。1）化学抑制型）化学抑制型（双柱型）：（双柱型）： 为消除流动相中为消除流动相中强电解质背景对强电解质背景对电导检测器的干电导检测器的干扰，设置了扰，设置了抑制抑制柱柱。双柱型离子。双柱型离子色谱仪的流程示色谱仪的流程示意图如右图所示意图如右图所示如如分析阴离子分析阴离子时：时： 交换交换ROH-Na+Br- RBr-Na+OH- 洗脱洗脱R R为阴离子树脂为阴离子树脂，BrBr- -为分离分析的阴离子。洗脱为分离分析的阴离子。洗脱液为液为NaOHNaOH。为了保证电导检测

15、器的灵敏度，在抑。为了保证电导检测器的灵敏度，在抑制柱上有：制柱上有：R RH H+ +NaNa+ +OHOH- - R RNaNa+ +H H2 2O OR RH H+ +NaNa+ +BrBr- - R RNaNa+ + H H+ + Br Br- - 洗脱液从抑制柱出来变成了水，洗脱液从抑制柱出来变成了水，而而阴离子阴离子被转成了酸的形式被转成了酸的形式，而，而H H+ +离子的摩尔电导率又离子的摩尔电导率又大大的高于大大的高于NaNa+ +，所以就大大的提高了检测阴，所以就大大的提高了检测阴离子的灵敏度。离子的灵敏度。 阳离子分析阳离子分析：无机酸为洗脱液，抑制柱上无机酸为洗脱液，抑制

16、柱上的反应：的反应：ROH-H+Cl- RCl-H2OROH-M+Cl- RCl-M+ OH- 洗脱液从抑制柱出来变成了水洗脱液从抑制柱出来变成了水；阳离子转阳离子转成了碱的形式。成了碱的形式。同样，同样，OHOH- -离子的摩尔电导率又离子的摩尔电导率又高于高于ClCl- -，提高了检测阴离子的灵敏度。，提高了检测阴离子的灵敏度。2 2）非抑制型（单柱型，不采用抑制柱）非抑制型（单柱型，不采用抑制柱） 用低电导的洗脱液用低电导的洗脱液阴离子分析阴离子分析：1 11010-4-45 51010-4-4mol/Lmol/L的苯甲酸盐或的苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐稀溶液，邻苯二甲酸盐稀溶液，背景电导值

17、低，背景电导值低，能分离和显能分离和显示试样中示试样中F F- -，ClCl- -，NONO3 3- -和和SOSO4 42-2-等阴离子的电导；等阴离子的电导；阳离子分析阳离子分析：用稀硝酸，乙二胺硝酸盐稀溶液作为用稀硝酸，乙二胺硝酸盐稀溶液作为洗脱液。洗脱液。六、空间排阻色谱（六、空间排阻色谱（SEC） 固定相：固定相：凝胶凝胶( (具有一定大具有一定大小孔隙分布小孔隙分布) )； 原理原理：按分子大小分离。按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙小分子可以扩散到凝胶空隙中通过，出峰最慢；中等分中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥

18、中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。小，故在最后出峰。 SECSEC的特点：的特点：（1 1）试样全部在溶剂的保留时间前出峰；试样全部在溶剂的保留时间前出峰；柱内停柱内停留时间短，峰扩展比其他方法小，留时间短，峰扩展比其他方法小，峰通常都很窄峰通常都很窄，有利于检测；有利于检测；（2 2）固定相和流动相选择简便固定相和流动相选择简便；SECSEC用于分离相对用于分离相对分子质量较大的物质（分子质量较大的物质（20002000以上），合适条件下，以上），合适条件下，也可分离相对分子质量小于也可分离相对分子质量小于100100的化合物。的化合物

19、。相对分子相对分子质量在质量在1001008 810105 5的任何类型化合物，可溶于流动的任何类型化合物，可溶于流动相的，都可用相的，都可用SECSEC进行分离进行分离。 不能分离大小相近，相对分子质量接近的分不能分离大小相近，相对分子质量接近的分子。子。如异构体等。如异构体等。它它只能分离相对分子质量相差只能分离相对分子质量相差10%10%以上的分子以上的分子。 对于一些高聚物对于一些高聚物，由于其组分相对分子质量，由于其组分相对分子质量的变化是连续的，的变化是连续的，虽不能虽不能SECSEC分离，但分离，但可以测定可以测定其相对分子质量的分布（分级）情况其相对分子质量的分布（分级）情况，

20、这正是我这正是我们需要的。们需要的。分析实例：分析实例： 3-43-4高效液相色谱法固定相高效液相色谱法固定相 1. 1. 液液- -液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相 （1 1）全多孔型担体）全多孔型担体 氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100100m m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。 现使用最广泛的是现使用最广泛的是5 51010m m的全多孔微粒担体。的全多孔微粒担体。 （2 2）表面多孔型担体）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）（薄壳型微珠担体） 30

21、304040m m的玻璃微球，的玻璃微球，表面附着一层厚度为表面附着一层厚度为1 1 2 2m m的多孔硅胶。的多孔硅胶。 表面积小，柱容量低。表面积小，柱容量低。（3 3）化学键合固定相）化学键合固定相 化学键合固定相：应用最广、性能最佳的固定相。化学键合固定相：应用最广、性能最佳的固定相。 a. a. 硅氧碳键型：硅氧碳键型： SiSiO OC C b. b. 硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiSiO OSi Si C C 稳定，耐水，耐光，耐有机溶剂，应用最广。稳定，耐水，耐光，耐有机溶剂，应用最广。 c. c. 硅碳键型：硅碳键型： SiSiC C d. d. 硅氮键型：硅氮键型： Si

22、SiN N化学键合固定相的特点：化学键合固定相的特点：（1 1）传质快传质快，表面无深凹陷。，表面无深凹陷。（2 2）寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定。耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定。 （4 4）选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性。，可键合不同官能团，提高选择性。（5 5）有利于梯度洗脱有利于梯度洗脱。存在着存在着双重分离机制双重分离机制：( (键合基团的覆盖率决定键合基团的覆盖率决定) )高覆盖率：分配为主；高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主低覆盖率：吸附为主。 2.2.液液- -固吸附分

23、离固定相固吸附分离固定相 种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。种类有种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。种类有限，应用面相对较窄。限，应用面相对较窄。 结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：粒度：5 510 10 m m。 3.3.离子交换色谱离子交换色谱分离固定相分离固定相 结构类别：结构类别：（1 1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%1%的离子交的离子交换树脂。换树脂。（2 2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团

24、）。交换基团）。 树脂类别：树脂类别：（1 1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）。）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）。（2 2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）。）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）。 4. 4. 空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相（1 1）软质凝胶）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构。葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构。 水为流动相。水为流动相。适用于常压排阻分离适用于常压排阻分离。（2 2）半硬质凝胶）半硬质凝胶 苯乙烯苯乙烯- -二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶。二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶。 非极性有机溶剂为流动相非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等

25、极性溶剂，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3 3）硬质凝胶）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔硅胶、多孔玻珠等；多孔玻珠等； 化学稳定性，热稳定性好，机械强度大，流动相性质影响化学稳定性，热稳定性好，机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。3-53-5高效液相色谱法流动相高效液相色谱法流动相 LC中：固定相选定，流动相的种类、配比，显著影中：固定相选定，流动相的种类、配比，显著影响分离效果，因此响分离效果，因此流动相的选择很重要流动相的选择很重要。一、在在选择流动相时应注意下列几个因素

26、选择流动相时应注意下列几个因素：1.1.流动相的纯度流动相的纯度 一般用一般用ARAR级试剂级试剂，必要时进一步，必要时进一步纯化除去杂质。溶剂不纯，长期使用中因杂质积累导纯化除去杂质。溶剂不纯，长期使用中因杂质积累导致监测器噪音增大，也影响馏分纯度；致监测器噪音增大，也影响馏分纯度；2 2. .避免用引起柱效损失或保留特性变化的溶剂避免用引起柱效损失或保留特性变化的溶剂；3.3.对试样要有适宜的溶解度对试样要有适宜的溶解度；4.4.溶剂的溶剂的粘度小粘度小些为好；些为好；5.5.应应与检测器相匹配与检测器相匹配；二、二、选用溶剂时，溶剂的极性为重要的依据。选用溶剂时，溶剂的极性为重要的依据。

27、 采用正相液采用正相液- -液分配分离时：首先选择中等极性溶液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。使保留时间缩短。 常用的溶剂极性顺序常用的溶剂极性顺序如下：如下： 水甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二水甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六环四氢呋喃甲乙酮正丁烷醋酸乙醇乙醚氧六环四氢呋喃甲乙酮正丁烷醋酸乙醇乙醚异丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯氯丙烷甲异丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯氯丙烷甲苯四氯化碳二硫化碳环乙烷乙烷庚

28、烷煤油苯四氯化碳二硫化碳环乙烷乙烷庚烷煤油（极性最小）。（极性最小）。 *获得合适的溶剂强度（极性）获得合适的溶剂强度（极性）: :二元或多元二元或多元组合的溶剂系统作为流动相组合的溶剂系统作为流动相。 * *根据溶剂的作用，分为根据溶剂的作用，分为: :底剂及洗脱剂底剂及洗脱剂。 * *底剂底剂决定基本的色谱分离情况；决定基本的色谱分离情况； * *洗脱剂洗脱剂起调节试样组分的滞留起调节试样组分的滞留并对某几个组并对某几个组分具有选择性的分离作用。分具有选择性的分离作用。 * *洗脱剂的组合选择直接影响分离效率。洗脱剂的组合选择直接影响分离效率。 正相色谱正相色谱：底剂用低极性溶剂底剂用低极

29、性溶剂如正己烷、如正己烷、苯、氯仿等；而洗脱剂则根据试样的性质选苯、氯仿等；而洗脱剂则根据试样的性质选取极性较强的针对性溶剂如醚、酯、酮和酸取极性较强的针对性溶剂如醚、酯、酮和酸等。等。 反相色谱反相色谱：以水为流动相的主体以水为流动相的主体，加入，加入不同配比的有机溶剂作调节剂。常用的溶剂不同配比的有机溶剂作调节剂。常用的溶剂是甲苯、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等。是甲苯、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等。 离子交换色谱离子交换色谱：分析分析在在含水介质含水介质中中进行。组分的进行。组分的保留值可用流动相中盐的浓度（或离子强度）和保留值可用流动相中盐的浓度（或离子强度）和pHpH来控来控制，增加盐的浓

30、度导致保留值降低。对制，增加盐的浓度导致保留值降低。对阳离子交换柱，阳离子交换柱，流动相流动相pHpH值增加使保留值降低；而值增加使保留值降低；而阴离子交换柱中，阴离子交换柱中，情情况相反。况相反。 排阻色谱法排阻色谱法：溶剂必须与凝胶本身非常相似溶剂必须与凝胶本身非常相似，这样，这样才能润湿凝胶并防止吸附作用。用软质凝胶时，才能润湿凝胶并防止吸附作用。用软质凝胶时，溶剂必溶剂必须能够溶胀凝胶须能够溶胀凝胶。溶剂黏度是重要的溶剂黏度是重要的，高黏度将限制扩，高黏度将限制扩散作用损害分辨率。对高分子有机物，溶剂多为：四氢散作用损害分辨率。对高分子有机物，溶剂多为：四氢呋喃、甲苯、间甲苯酚、呋喃、甲苯、间甲苯酚、N,N-N,N-二甲基甲酰胺等；生物物二甲基甲酰胺等；生物物质分离主