空调冷却水中军团菌污染状况和检测方法探讨

1、作者简介马永(1966-,女,工程师,主要从事微生物检测和产品杀菌性能的测定。【综述】空调冷却水中军团菌污染状况和检测方法探讨马永,吴清平,张菊梅,杨小鹃(广东省微生物研究所,广东省微生物分析检测中心,广州510070中图分类号R12311文献标识码A文章编号1004-8685(200502-0255-02近两年,我国境内爆发的冠状病毒感染的非典型肺炎和禽流感两种呼吸道传染病,提醒我们对呼吸道传染性疾病要有足够的重视,呼吸道传染病与其它疾病相比具有更强的传染性,隔离困难,对社会群体危害更严重。同属于呼吸道传染性疾病的军团菌(L egionella病,是70年代发现的一种急性细菌性传染病。197

2、6年7月美国退伍军人组织(美国兵团宾西法尼亚分团在费城召开大会,与会4400人聚集于该市一旅馆期间相继有221人患全身感染,伴突出的呼吸道和消化道症状和体征,34人死亡,因此称“退伍军人病”,后定名为“军团病”。军团菌自发现以来,国内外陆续有从病人及在外环境水中分离出军团菌的报道。它在临床缺乏独特的症状和体征,不易诊断,传染性强,严重可致人死亡。军团菌最可能的传播途径为空气,国内外关于军团菌的流行病学调查表明,空调冷却水与军团菌感染和流行有着密切关系,这类设施与生产、生活的接触较密切,引起军团菌流行爆发的可能性很大,近年来随着高大建筑的不断崛起,高层庞大的空调设施越来越多,这些地方的空调冷却水

3、源正是军团菌生长和繁殖的良好环境。近几年军团菌的检出率呈上升趋势。1国内外空调冷却水中军团菌污染状况据Ravi1Vel oo报道,在新加坡因空调冷却水引发的军团菌病,仅1992年15月报告病例37例,死亡5例。澳洲的调查表明超过50%的空调水冷却塔内部有军团菌生长;在国内也有相关报道,成都市1997年11月在宾馆中央空调冷却水中分离到军团菌,上海地区有关军团菌环境污染的监测资料表明,冷却塔水军团菌的检出率高达50%左右,而且很多监测点的含菌量已超过104cfu/m l;1997年6月北京某写字楼员工暴发上呼吸道感染108例,嗜肺军团菌感染率达45194%,因发现及时,疫情得以控制。1995年1

4、0月中国医科大学呼吸疾病研究所王琳等对沈阳市5家单位中央空调系统冷却塔进行细菌学调查,结果表明有军团菌存在。2空调冷却水中军团菌的检测方法由于军团菌营养要求较高以及杂菌混杂等因素,分离培养较为困难,如何提高空调冷却水中军团菌的检出率,是环境微生物学研究的一个重要课题。正确选择切实可行的检测方法是提高军团菌检出率的首要条件,现从以下几个方面加以分析。211水样的采集水样的采集直接影响实验的结果,采样容器应该选择化学惰性材料制成(如玻璃、聚丙烯并灭菌。根据检查规模及水样污染程度,采样量为10500m l,一般为250500m l,同一场所检样量越多,检出率越高,采样时,应测定水样的温度、pH、混浊

5、度及有无藻类的原虫,后两者与军团菌有共生关系。应重视采水点的选择,管道系统中橡胶垫圈处分离到军团菌的几率最大,水流在此阻塞和滞溜,有利于军团菌的定居。用棉拭采样,然后放入含有2m l无菌水的带帽试管中。212水样的处理水样的军团菌数量一般较低,可通过离心和过滤集菌以便提高检出率。离心法省时、省设备,尤其在水样较脏的情况下应优先考虑。过滤法应注意膜的化学构成和孔径大小,水样较清、量较大时更宜用过滤法。来自空调冷却水样一般都含有大量杂菌,样本处理非常重要。50份样品经酸处理(按110加012mol/L pH212HCl-KCl缓冲液,作用15m i m后调至中性或热处理(59±,3m i

6、n或603m in后接种MW Y选择培养基,酸处理或热处理后的阳性数均为23份,未处理阳性数为13份,处理样品阳性率大于未处理样品阳性率。在MW Y、BMP A、G VPC3种选择培养基上的杂菌数,未处理样品分别是730、1680、460;热处理分别是40、340、130;酸处理分别是1、3、<1。可见样品未处理直接接种,会造成大量杂菌生长,影响生长较慢的军团菌,降低军团菌的检出率。213利用军团菌与阿米巴的共生关系提高检出率军团菌与水中多种原生动物有共生关系,最常见的是棘头阿米巴,尤其是大型中央空调冷却塔,由于充足的阳光与日照,加上其适量的微量元素与不常清洗产生的有机物,可为许多藻类、

7、细菌和原虫的滋生提供有利条件,棘皮阿米巴的收缩性空泡可为军团菌的大量生长繁殖、聚集其所需的各种营养,军团菌在进入阿米巴体内4h后进入对数生长期,从而使水中军团菌达到可培养水平。将所采集的水样置35,孵育6周, 6周后每710d进行一次军团菌分离培养,但军团菌的检出率可提高一倍。214检测方法的选择(1细菌培养是权威机构认可的检测方法,此方法中增菌培养可以使检样中军团菌的数量增大,提高细菌分离阳性率。但它存在着分离过程复杂,培养时间长(35d,特异性培养基价格昂贵等问题。(2免疫血清学方法常被用作军团菌疾病流行病学回顾性调查时的检测方法,具有简便、快速之优点,但敏感性较细菌培养法低。(3尿抗原检

8、测是一种廉价、快速的检测方法,敏感性达70%,特异性接近100%。根据文献报道,尿中嗜肺军团菌抗原可存在1年。(4PCR及其相关技术检测军团菌的方法,当前国内外有常规PCR、PCR-探针法、套式PCR、半套式PCR、多重PCR、以PCR为基础的指纹图谱技术等。PCR技术与其它检测方法相比具有特异性强、灵敏度高和操作简单、快速等优点,更有利于军团菌的早期诊断。从特异性、灵敏性、可操作性、经济性等方面比较,半套式PCR特别适用于环境样本的检测,普通PCR的假阳性问题在半套式PCR中可被指示出来,重复性稳定性都很好。3不足与展望空调冷却水属于寡营养环境,在此环境中,军团菌进入静止期,培养困难。所以简

9、便、快速、可靠的检测方法对于空调冷却水中军团菌的监测是非常重要的,检测空调冷却水中军团菌应注意几个方面的问题:(1采集具有代表意义的水样;(2运用合适的水样处理方法;(3利用军团菌与阿米巴共生关系,进行共同培养,以提高阳性率;(4选择传统方法和现代分子生物技术相结合的检测方法,运用传统方法进行前培养,再用半套式PCR进行检测。目前存在的问题主要有:(1样品处理程序繁琐。传统方法用军团菌选择性培养基对水样进行分离纯化,培养周期长,培养结果有许多非军团菌细菌生长,要得到纯菌落,需要进一步的验证。(2半套式PCR技术虽具有简单、快捷和成本低等优点,但该方法及类似方法目前只能检测到属的水平。因此,要快

10、速、灵敏地检测空调冷却水中军团菌的种类,需改进传统的培养方法、设计特异性更高的PCR引物或杂交探针,结合免疫诊断技术,是将来研究的方向。参考文献1郭常义,阮素云1军团菌对人工水环境污染及预防的研究进展J.上海预防医学杂志,2003,15(4:181-18212肖钧1军团菌的污染和控制研究进展J1国外医学卫生学分册,2003,30(4:196-19913黄爱华,李君文1聚合酶链式反应检测军团菌的研究进展J1中国公共卫生,2002,18(10:1261-126214黄爱华,李君文1半套式PCR检测军团菌方法的建议及应用J1中国公共卫生,2002,18(9:1114-111615陆广珍,陈悦,沈健民

11、,等1军团菌的快速简易检测方法的建立及应用J1上海医学检验杂志,2001,16(1:38-3916邱琼,万超群,刘双,等1军团菌双重PCR检测方法的建立及其应用研究J12000,16(5:13-1617罗隆泽,谢仁栋,兰纪康,等1空调冷却水嗜肺军团菌的分离及鉴定报告J1预防医学情报杂志,1999,15(2:67-6818H ir oshi M iya mot o hir oyuki Ya mamot o keiko A ri m a,et al1Devel opmentof a new se m inested PCR method f or detecti on of legi onella

12、 s pecies and its app licati on t o surveillance of legi onellae in hos p ital cooling t ower waterJ1App lied and Envir onmental M icr obi ol ogy,1997,7:2489-249419P Declerck,L Verlst1A detecti on method for lengi onella s pp in(cool2ingwater:fluorescent in situhybridisati on(F I SHon whole bacteria

13、 waterJ1Science and Technol ogy,2003,47(3:143-146110Nele W ellinghausen,Cathrin Fr ost.Detecti on of legi onellae in hos p italwater sa mp les by quantitative real-ti m e lingt cycler PCRJ.Ap2 p lied and Envir onmentalM icr obi ol ogy,2001,9:3985-39931(收稿日期:2004-09-16(上接第254页H I V RNA l oad in bl oo

14、d p las maJ1Journal of V ir ol ogical Methods2000,89:177-18116Peggy S,ElsMC,O ls on1An invasive cleavage assay for direct quantita2ti on of s pecific RNA sJ1Nature,2001,19:673-67617Lya m ichev V,Mast A,Hall J,et al1Poly mor phis m identificati on andquantitative detecti on of genom ic DNA by invasiv

15、e cleavage of oligonu2 cleotide p r obesJ1Nat B i otechnol,1999,17:292-29618LJ Dre we,G Bright w elll,E AH Hall1Detecti on of PCR pr oducts usingP NA strand invasi onJ1Molecular and Cellular Pr obes,2000,14:269-28319Tho mas D,Nardone G,Randall S1Amplificati on of padl ock p r obes forDNA diagnostics

16、 by cascade r olling circle a mp lificati on or thepoly merase chain reacti onJ1A rch Pathol Lab Med1999,123:1170-11761 10Grabar K C,Free man RG,Hu mmerMB,et al1Preparati on and character2izati on of au coll oid monolayersJ1Anal Che m,1995,67:735-431 11Reichert J,Csaki A,Kohler J M,et al1Chi p-based

17、 op tical detec2ti on of DNA hybridizati on by means of nanobead labelingJ1Anal Che m,2000,72:6025-9112Tat on T A,M irkin CA,Letsinger RL1Scanometric DNA array detecti onwith nanoparticle p r obesJ1Science,2000,289:1757-601 13So-Jung Park,T Andre w Tat on,Chad A1M irkin:A rray-Based E2lectrical dete

18、cti on of DNA with nanoparticle p r obesJ1Science, 2002,295:1503-1506114Yun W ei Charles Cao,Rongchao J in,Chad A.M irkin31Nanoparti2cles with ra man s pectr oscop ic finger p rints f orDNA and RNA detecti on J1Science,2002,297:1536-1540115M11oller R,Csaki A,Kohler J M1Electrical classificati on of

19、the con2centrati on of bi oconjugated metal coll oids after surface ads or p ti on and silver enhance mentJ1Lang muir,2001,17:5426-30116Park SJ,Tat on T A,M irkin CA1A rray-based electrical detecti on ofDNA with nanoparticle p r obesJ1Science,2002,295:1503-61 17U rban M,Moller R,Fritzsche W1A paralleled readout system f or anelectrical DNA-hybridizati on assaybased on a m icr