牛磺酸抑制实验性肝纤维化大鼠细胞外基质沉积

1、    牛磺酸抑制实验性肝纤维化大鼠细胞外基质沉积        摘要目的 研究牛磺酸抗肝纤维化作用。 方法 用四氯化碳（CCl4)制备肝纤维化模型；免疫组化检测肝、型胶原和透明质酸、层粘连素沉积；Northern blot杂交检测肝、型前胶原、组织金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1) mRNA含量。 结果 CCl4肝纤维化大鼠肝脏、型胶原、透明质酸和层粘连素染色明显增多；、型前胶原、TIMP-1 mRNA显著增加。牛磺酸处理的大鼠，上述各指标的阳性染色明显减少，并可明显抑

2、制、型前胶原基因表达，而对TIMP-1 mRNA却无明显影响。 结论 牛磺酸对CCl4诱导的大鼠肝纤维化具有保护作用，可明显抑制纤维生成与沉积。提示它对防治肝纤维化有一定的临床意义。关键词牛磺酸 细胞外基质 前胶原 组织金属蛋白酶抑制因子-1 基因Taurine inhibites deposition of extracellular matrix in experimental liver fibrosis in ratsCHEN Yuexiang, LI Shi, ZHANG Xingrong, et al.Department of Gastroenterology, Changzhe

3、ng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003AbstractObjective To study the effect of taurine on liver fibrosis and its mechanism. Methods Fibrosis was induced by the administration of carbon tertrachloride(CCl4) in rats. Some of the animals were treated with taurine. The rats wer

4、e killed after 12 weeks of CCl4 treatment. Depositions of type , and collages, laminin and hyaluronic acid were studied in liver sections by immunohistochemical technique using specific antibody. The hepatic contents of type , procollage and tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-) mRNA were d

5、etermined by Northern blot hybridyzation. Results A significant elevations of hepatic collagen , , , laminin and hyaluronic acid were observed after 12 weeks of liver injury in animals without taurine treatment, and a definite increase in the amounts of hepatic type , procollagen and TIMP-1 mRNA was

6、 noted. Taurine prevented increases in type , procollagen mRNA expression as well as the accumulation of the collagens, laminin and hyaluronic acid in the liver. Conclusion The data indicate that taurine has a protective effect in CCl4-induced hepatic fibrosis. The results suggest taurine might be o

7、f potential value in clinical practice.Key wordsTaurine Extracellular matrix Procollagen Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 Gene我们以前工作发现，牛磺酸可有效减轻四氯化碳（CCl4）所致大鼠肝纤维化程度，降低肝脏羟脯氨酸含量和透明质酸（HA）、层粘连素（LN）水平，改善肝功能。为进一步研究牛磺酸抗肝纤维化作用，本实验采用免疫组织化学法和Northenr blot杂交技术观察其对肝纤维化大鼠细胞外基质（ECM）沉积的影响。材料和方法一、试剂及动物牛磺酸（湖州市

8、生物化学试剂厂）；CCl4（宜兴市第二化学试剂厂）；兔抗、型胶原抗体由上海医科大学病理教研室提供；兔抗LN抗体为本院自制；兔抗HA抗体由张橹榕博士惠赠；ABC试剂盒为Vector公司产品；异硫氰酸胍、Mops为Watson公司产品；限制性内切酶EcoR、Hind购自华美生物技术公司；a2()、a2()前胶原cDNA由美国Prockop博士惠赠；组织金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)cDNA由加盒大Edwards博士惠赠；地高辛标记及检测试剂盒为Boehringer-Mannheim公司产品。雌性SD大鼠，135175g，由本校实验动物中心提供。二、肝纤维化模型制备及其分组将大鼠随机分为3组

9、：正常组（8只），CCl4组（16只），牛磺酸组（12只）。采用CCl4制备肝纤维化模型1，即用3/2（V/V）CCl4橄榄油溶液0.3ml/100g体重腹部皮下注射，每周2次，共12周。牛磺酸组在造模开始时，给予牛磺酸，每日250mg/kg背部皮下注射。CCl4组除CCl4外，给予等量生理盐水。正常组仅给予生理盐水。各组动物在最后一次CCl4注射后48小时断头处死，取部分右叶肝用体积分数为10%甲醛固定、石蜡包埋或液氮速冻。三、免疫组化染色石蜡包埋块4m连续切片或冰冻切片，采用ABC法作免疫组化染色。主要步骤：(1)石蜡切片梯度水化或冰冻切片丙酮固定；(2)加10%正常血清封闭20分钟；(3

10、)加特异性抗体(一抗）40过夜；(4)加生物素化二抗373分钟；(5)加ABC试剂（1:100）3740分钟；(6)1.0mmol/L DAB-H2O2显色10分钟；(7)苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。以PBS替代一抗作空白对照，正常血清替代二抗作替代对照，结果均为阴性。棕褐色为阳性染色。四、Northern blot杂交1.探针制备与标记：前胶原a2(I)、a2()和TIMP-1质粒经转化、扩增，以碱裂解法抽提，分别用EcoR、Hind酶切后，低溶点胶回收并电泳鉴定。cDNA标记按地高辛标记试剂盒标记。2.总RNA提取：取液氮冻存肝组织约500mg，以异硫氰酸胍一步法提取总RN

11、A，核酸蛋白分析仪（DU-600，Beckman）测定其浓度及纯度，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。结果示A值260/A值280为1.82.0，电泳28s和18s区带清晰集中，表明所提取之RNA纯度良好且未降解。3.Northern印迹转移与杂交：取20g RNA，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳后Northern印迹转移至尼龙膜（QIAGEN），80烘烤2小时，6×SSC浸泡湿润后，装入杂交袋中，加预杂交液，预杂交424小时。弃去预杂交液，加杂交液（含特异性cDNA探针60100ng/ml）4216小时。杂交后依次用2×SSC 0.1%SDS、0.1×SSC 0.1%

12、SDS洗，加150mU/ml抗地高辛抗体3730分钟，加显色液避光显色34小时。水洗后，照相并计算机灰度扫描。结 果一、牛磺酸对ECM沉积的影响用特异性抗体作免疫组化染色来分析纤维化肝脏ECM成分的沉积。结果发现，注射CCl4 12周，肝窦、汇管区、中央静脉周围、型胶原阳性染色较正常肝脏显著增多（1、2，见插页）。LN和HA染色也明显增强，并主要分布于肝窦（3，见插页）。1CCl4组肝脏I型胶愿免疫组化(ABC100)2CCl4组肝脏IV型胶原免疫组化(ABC100,冰冻切片)3CCl4组肝脏HA免疫组化(ABC100)牛磺酸治疗的大鼠肝脏，上述成分的免疫组化阳性染色较CCl4组减少（46，见

13、插页），表明牛磺酸可减少、型胶原和LN、HA在肝脏的沉积。4牛磺酸组肝脏I型胶愿免疫组化(ABC100)5牛磺酸组肝脏IV胶原免疫组化(ABC100,冰冻切片)6牛磺酸组肝脏HA免疫组化(ABC100)二、牛磺酸对、型前胶原、TIMP-1 mRNA表达的影响Northern blot杂交结果显示，CCl4组大鼠肝脏、型前胶原mRNA分别较正常组增加5.6、4.40倍。牛磺酸组I、型前胶原mRNA分别增加2.92、2.45倍，其增加的程度均较CCl4组减轻。CCl4组大鼠TIMP-1 mRNA表达增强（较正常组增加2.17倍），牛磺酸治疗对TIMP-1基因表达无明显影响。讨 论本实验观察到，CC

14、l4注射12周，肝窦、汇管区、中央静脉周围、型胶原较正常肝脏显著增加，LN和HA亦明显增多（主要分布于肝窦），且肝脏、型前胶原mRNA表达增强，分别较正常肝脏增加5.6和4.4倍。牛磺酸治疗可明显减少肝脏、型胶原、LN和HA沉积，、型前胶原mRNA含量也明显降低。表明牛磺酸能有效抑制纤维生成（fibrogenesis）和沉积。牛磺酸的这种作用可能与其保护肝细胞2，3、抑制贮脂细胞、成纤维细胞增殖和胶原等ECM合成4，5以及抑制脯氨酰羟化酶活性6有关。牛磺酸可抑制体外培养的肾小球系膜细胞的转化生长因子1(TGFb1) mRNA表达7。在博莱霉素所致大鼠肺纤维化模型上，牛磺酸对TGF1基因表达亦有

15、显著抑制作用8。由于TGF11是肝纤维化发生发展的一个重要介质，因此，牛磺酸抑制该基因表达可能是其对肝纤维生成与沉积发挥抑制作用的重要机理。ECM降解受一系列酶即基质金属蛋白酶（MMPs）催化。MMPs包括间质胶原酶、明胶酶及基质溶解素，其活性可被组织金属蛋白酶抑制因子（TIMPs）抑制，后者包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3，其中TIMP-1主要抑制间质胶原酶。近年研究表明，肝纤维化过程中间质胶原酶活性明显下降，而TIMP-1持续超常表达则是间质胶原酶活性下降的主要原因9。本实验观察到，CCl4肝纤维化大鼠存在肝脏TIMP-1 mRNA表达增加，但牛磺酸对TIMP-1基因表达却无明

16、显影响，提示牛磺酸不能通过抑制TIMP-1表达而促进纤维降解（fibrolysis），但牛磺酸是否能拮抗TIMP-1的生物学效应抑或促进MMPs活性，尚待进一步研究。作者简介:陈岳祥男,36岁,博士,发表论文30余篇,参编专著3部,主要从事肝细胞损伤及肝纤维化发病机理与防治研究作者单位:陈岳祥李石张兴荣张忠兵孔宪涛上海第二军医大学长征医院参考文献1陈岳祥，黄裕新，王庆莉，等. 抗TNFa单抗对实验性大鼠肝纤维化的影响. 中华消化杂志，1997，17：358-359.2陈岳祥，黄裕新，赵国宁，等. 急性肝损伤大鼠肿瘤坏死因子a含量变化及牛磺酸治疗作用的研究. 解放军医学杂志，1995，20: 2

17、06-207.3陈岳祥，王慎传，赵国宁，等. 牛磺酸抗肝脏缺血再灌注损伤及其机理的实验研究. 中华医学杂志，1993，73: 276-279.4陈岳祥，李石，范列英，等. 牛磺酸抑制大鼠贮脂细胞、肝细胞增殖及前胶原基因表达. 中华肝脏病杂志，1997, 5: 150-153.5陈岳祥，李石，孔宪涛. 牛磺酸对成纤维细胞增殖及功能的影响. 第二军医大学学报，1996, 17: 548-550.6Wang Q, Giri SN, Hyde DM, et al. Amelioration of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in hamsters by c

18、ombined treatment with taurine and niacin. Biochem Pharmacol, 1991, 42: 1115-1122.7Studer RK, Craven PA, Dekubertis FR. Antioxidant inhibition of protein kinase C-signaled increases in transforming growth factor-beta in mesangial cells. Metablosim, 1997, 46: 918-925.8Gurjeyalakshmi G, Hollinger MA, Giri S