阿托伐他汀对鼠动脉粥样硬化基质金属蛋白酶和C-反应蛋白的影响

1、阿托伐他汀对鼠动脉粥样硬化基质金属蛋白酶和C-反应蛋白的影响         08-08-13 16:08:00     编辑：studa20                作者：章义利 戴凌燕 周秀云 应斌宇 张怀勤     【摘要】  目的 探讨阿托伐他汀对动脉粥样硬化鼠主动

2、脉基质金属蛋白酶2、9（MMPs）及血中C-反应蛋白（CRP）的影响。方法 将雌性SD大鼠50只分为对照组(=10,正常饮食)、模型组(=20,维生素D3+高脂饲料+正常饮食)、阿托伐他汀组(=20,维生素D3+高脂饲料+阿托伐他汀)。4个月后处死，取主动脉起始部行光镜和电镜观察，其余部分用于免疫印迹法检测MMPs的表达水平。于实验前及实验结束时对实验鼠行空腹股动脉取血,分离血清,检测血清胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平以及CRP的水平。 结果 实验前各组大鼠血脂学及CRP水平差异无显著性，实验结束时模型组TC、TG、LDL显著高于对照组（P

3、<0.01）, 阿托伐他汀组低于模型组(高于对照组)；MMP-2、MMP-9相对值模型组8618±549和9054±350，明显高于对照组的表达(对照组5314±163和6178±254)，而阿托伐他汀组3397±453和6805±368，低于模型组(P<0.01)；CRP模型组（18.64±0.94)mg/L，显著高于对照组的（9.21±0.2）mg/L，而阿托伐他汀组(12.52±0.65)mg/L，显著低于模型组（P<0.01）。对照组主动脉病理学改变比阿托伐他组显著，对照组改变不

4、明显。 结论 阿托伐他汀能抑制基质金属蛋白酶和CRP的表达，在稳定粥样斑块过程中可能起重要作用。 【关键词】  动脉粥样硬化 阿托伐他汀 基质金属蛋白酶 C-反应蛋白【Abstract】  Objective  To investigate the effect of atorvastatin on expression of C-reactive protein (CRP) and matrix metalloproteinase-2,9 in experimental atherosclerosis of rats. Methods  Fifty f

5、emale Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal diet group (n=10,control group); vitamin D3 injection and high cholesterol diet group (n=40). After 8 weeks, vitamin D3 injection and high cholesterol diet rats were randomly switched to received atorvastatin (5mg.kg-1.day-1) (n=20,atorvast

6、atin group) or normal diet (n=20, model group).Another eight weeks later, all the rats were killed and some of their aortas were observed by light and electron microscope, the left aortas were removed for western blot analysis to detect MMP-2,-9 . At the begin and end of experiment, serum was collec

7、ted for serum lipid and CRP determining. Results  There were no significant changes in serum lipids and CRP at the beginning of experiment between the groups ,But after two months, Cholesterol, low density lipoprotein(LDL), triglyceride(TG) of atorvastatin group were significantly lower than th

8、ose of model group(P<0.01) but higher than control group(P<0.01). The pathologic changes of atorvastatin group were less serious than those of model group, there was not any pathological changes in control group. MMP-2,-9 were significantly higher in the model group(8618±549， 9054±35

9、0,respectively) than those in the control group(5314±163 ，6178±254) (all P<0.01 ), But compared with the model group, MMP-2,-9 levels were markedly lower in the atorvastain group（3397±453， 6805±368）(all P<0.01). The levels of CRP in the model group(18.64±0.94 mg/L) wer

10、e higher than those in the control group (9.21±0.21 mg/L) (P<0.01). CRP levels also differed significantly between control group and atorvastain group(12.52±0.65mg/L)(P<0.05). Conclusions  Atorvastatin inhibitis MMPs and CRP 's express ,which may play an important role in pl

11、aque stabilization.【Key words】  Atheroslerosis  Atorvastatin  Matrix metalloproteinases  C-reactive protein    他汀类药物除具有良好的调脂作用外，还具有改善内皮功能失调、抑制炎症反应、抗血栓形成、稳定斑块并能抑制平滑肌细胞增殖、迁移和不良的血管重塑等作用，2，这些作用能降低心脑血管疾病的发生率和死亡率，在心脑血管疾病的一级和二级预防中具有重要的作用和意义。本研究旨在探讨阿托伐他汀对动脉粥样硬化鼠主动脉基质金属蛋白酶2

12、、9及血中C-反应蛋白(CRP)的影响。1  材料与方法1.1  实验动物与试剂  雌性SD大鼠50只，清洁级，日龄3045d，体重150200g；维生素D3购自上海第九制药厂，甲巯咪唑购自上海中西药业公司，胆酸钠购自温州生物化学制药厂，胆固醇购自北京化学试剂公司，猪油为市售食用猪油；阿托伐他汀由辉瑞公司惠赠，MMPs免疫印迹试剂盒购自武汉博士德生物公司,硝酸纤维素膜 Sigma公司提供。1.2  大鼠动脉粥样硬化(AS)模型的建立3  将大鼠随机分为对照组(C组，n=10,)、模型组(M组，=20)、阿托伐他汀组(A组，=20)。对照组大鼠喂

13、普通饲料, 模型组和阿托伐他汀组大鼠先腹腔注射维生素D3（70万IU/kg，分4次，1次/2d），然后喂食高脂饲料(1%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.1%甲巯咪唑、5%猪油，93.4为基础饲料)。2个月后，阿托伐他汀组大鼠强制性喂食含阿托伐他汀（5mg/kg）的颗粒饲料(5g/只)后，再补充15g普通颗粒饲料；模型组大鼠喂普通饲料。所有大鼠均分笼按清洁级动物饲养,饮用洁净水，整个试验周期为4个月。1.3  标本的收集与处理  各组动物分别于实验前及实验结束时行空腹股动脉取血,分离血清,用以血脂学检验，并于实验结束时将其处死, 立即取主动脉(从主动脉弓至腹主动脉分叉处)，截取主

14、动脉弓放入4%多聚甲醛固定液中固定，石蜡包埋、切片、HE染色，光镜观察其形态；在主动脉起始处切取主动脉组织块，用2.5%戊二醛中固定以备电镜观察；剩余的主动脉置于液氮中然后储存于80冰箱,用于免疫印迹。在整个试验中，共有15只大鼠死亡或中途用于观察动脉粥样硬化形成情况。1.4  主动脉形态学观察  4%多聚甲醛固定液中固定的主动脉脱水，石蜡包埋，切成约4m厚切片，HE染色，光镜下进行形态学观察；将固定在2.5%戊二醛中的主动脉切成1 mm×1 mm×1 mm的组织块，用1%锇酸固定6h，EPON812包埋，LKB-V型超薄切片机切片，常规染色，H-600

15、型透射观察主动脉内膜、中膜的超微结构改变。1.5   MMPs免疫组化  石蜡包埋的主动脉组织切成4m厚切片，采用SP法,用PBS代替一抗作阴性对照,已知阳性切片作阳性对照。1.6  MMPs免疫印迹分析  称取60100mg低温保存的主动脉组织,放入洗净的研钵中,小心加入一定量的液氮后,快速研磨成粉状,再按1:10(mg /L)加入匀浆缓冲液50mmol/L-Cl(pH8.0),150mmol/L NaCl,0.1%SDS,0.5%去氧胆酸钠继续研磨成匀糊状。Bradford法测定蛋白量。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),

16、电转移,稀释MMP2、9的一抗1：300,4下与硝酸纤维素膜结合过夜。TBS液洗涤硝酸纤维素膜10min×3次。1400稀释二抗,37下与膜结合30min。TBS液洗涤硝酸纤维素膜10min×3次,1:50稀释链酶亲和素标记生物素抗体,37下与膜结合31min。TBS液洗涤硝酸纤维素膜10min×3次,然后显色,ImageMasterVDS凝胶成像扫描分析仪扫描存挡,读取各条带蛋白质的相对含量。1.7  血脂学及CRP检验  用日立7600生化全自动分析仪检测TC、TG、HDL水平。LDL通过(TC-HDL-TG)/2.2来获得。CRP采用ELISA法检测。1.8  统计学处理  采用SPSS 11.0 软件。数据