乙型肝炎核酸疫苗肌注小鼠后质粒的存续及局部组织内C-mycm

1、    乙型肝炎核酸疫苗肌注小鼠后质粒的存续及局 部组织内C-myc mRNA的检测        摘要 目的 研究乙型肝炎核酸疫苗质粒NV-HB/s接种小鼠后小鼠产生体液免疫应答的规律、质粒在注射局部的存续规律及对癌基因C-myc的可能影响。方法 ELISA法检测小鼠外周血中的抗HBs；分别用原位杂交和Southern吸印杂交检测小鼠肌组织标本中的疫苗质粒；并以原位杂交检测肌组织中的C-myc mRNA。结果 小鼠在接种NV-HB/s后1月均已产生抗HB

2、s，肌组织中NV-HB/s DNA的原位杂交结果阴性，仅Southern吸印杂交结果阳性。且检出率至接种后6月时已降至25%；C-myc mRNA的检测结果为阴性。结论 NV-HB/s接种小鼠后能诱导小鼠产生抗HBs，质粒DNA会随时间延长而逐渐被降解；在免疫后6月内质粒的注入未见癌基因C-myc的激活。关键词 乙型肝炎 质粒 疫苗 核酸类 C-myc基因Detection of NV-HB/s DNA and c-myc mRNA in mice inoculated with hepatitis B nucleic acid vaccineNV-HB/s QIN Shan,ZHAO Lia

3、nsan,TANG Hong,et al.Viral Hepatitis Research Unit,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041Abstract Objective To explore the persistence period of plasmid in mice muscles injected with NV-HB/s and the possible influence on oncogen C-myc.Methods Anti-HBs was detected by ELISA;NV-HB/s

4、was detected by In-situ and Southern-blot hybridization separately;C-myc mRNA was detected by In-situ hybridization.Results All mice injected with NV-HB/s were positive of anti-HBs after 1 month of immunization;NV-HB/s was negative when detected by In-situ hybridization;By Southern-blot hybridizatio

5、n,the positive rates of NV-HB/s were decreasing from 100% in 2 months to 25% after 6 months of inoculation.Conclusions NV-HB/s would be disintegrated little by little after injected into mouse muscles;no C-myc activation was observed in 6 months after NV-HB/s inoculation.Key words Hepatitis B Plasmi

6、d Vaccine Nucleic acids C-myc gene用乙型肝炎(简称乙肝)核酸疫苗NV-HB/s接种小鼠，诱导小鼠产生了特异性体液免疫应答，可使外周血抗-HBs阳转1。在此，拟探讨核酸疫苗质粒在接种局部存续的规律及对癌基因C-myc的可能影响。材料与方法1.乙肝核酸疫苗NV-HB/s的制备：将乙肝病毒表面抗原(HBsAg)主蛋白编码基因S定向插入真核细胞表达质粒pRc/CMV/ATG中的CMV启动子下游获得重组质粒，以此转染真核细胞(小鼠肥大细胞瘤P815)可高效表达HBsAg主蛋白；经常规质粒扩增、抽提、纯化后制得重组质粒DNA纯品，以1 mg/ml的浓度溶于PBS(pH7.

7、2)，即为乙肝核酸疫苗NV-HB/s。2.小鼠接种：实验动物BALB/c小鼠均为68周龄，分为实验组和对照组。实验组小鼠接种乙肝核酸疫苗NV-HB/s，每侧胫前肌各肌注50 ml(1g/L)，即总量100 mg/只。对照组包括：(1)空白对照组：每侧胫前肌各肌注50 ml PBS。(2)阴性对照组：每侧胫前肌各肌注50 mg(50 ml)空载质粒pRc/CMV/ATG。(3)阳性对照组：每侧胫前肌各肌注乙肝血源疫苗(成都生物制品研究所产，批号：950304)0.5 mg，总量1 mg。3.接种疫苗后肌注部位NV-HB/s DNA的原位杂交检测：于接种后3天、1周、2周、1月、2月、4月、6月分

8、别处死小鼠，分离胫前肌，一份常规甲醛液固定，石蜡包埋、切片，另一份置-70冻存备检；同时采集眶静脉血，分离血清，置-70冻存备检抗-HBs。待所有标本收集完成后，以Dig-pRc/CMV探针(地高辛配基标记pRc/CMV/ATG质粒DNA，由本室制备，标记药盒购自Boerhinger Mannheim公司)用原位杂交法检测石蜡切片组织中的NV-HB/s DNA。操作程序参照文献2进行。4.接种部位NV-HB/s质粒DNA的Southern杂交检测：取-70冻存的组织标本，匀浆化后抽提DNA，以Dig-pRc/CMV探针做Southern吸印杂交，用NV-HB/s作为阳性对照。5.肌注NV-HB

9、/s后组织中C-myc mRNA检测：取石蜡切片标本，以Dig-C-myc cDNA探针(标记药盒购自Boerhinger Mannheim公司)用原位杂交法检测组织中的C-myc mRNA。操作程序同前。6.小鼠外周血中抗-HBs的检测：所有血清标本收集完成后，在同一条件下用酶联免疫法(ELISA)检测抗HBs(ELISA试剂盒购自华美生物工程公司)，操作方法按说明书进行。结果1.肌注NV-HB/s后质粒在局部组织的存续规律：利用Southern吸印杂交技术在肌肉标本DNA抽提物中检出了质粒DNA的存在，肌注后3天、2周、1月、2月的DNA检出率均为100%；此后检出率呈逐渐下降的趋势，接种

10、后4月的检出率为67%(4/6)，至接种后6月实验结束时，仍能检出NV-HB/s质粒DNA的存在，但检出率已降至25%(2/8)。质粒DNA的总检出率为72%。在同一肌肉组织标本中，利用原位杂交技术检测石蜡切片组织中的上述质粒DNA，结果均为阴性。2.肌注NV-HB/s后局部组织中C-myc mRNA的检测结果：肌注NV-HB/s后3天至6月的标本中C-myc mRNA均为阴性；所设阳性对照结果为阳性；不加探针的空白对照则为阴性。3.肌注NV-HB/s后，小鼠外周血中抗-HBs检出的规律：肌注NV-HB/s后3天及1周处死受检的7只小鼠，在其外周血中尚未能检出抗-HBs，但在接种后2周处死的3

11、只小鼠中，已有2只抗-HBs阳转；此后，外周血中抗-HBs检出率进一步增高。自接种后1月起，22只受检实验鼠外周血中均能检出抗-HBs，并保持至第6月实验结束时仍为100%阳性。实验设定的阳性对照组小鼠外周血中抗-HBs检测结果呈阳性，阴性对照及空白对照组小鼠的抗-HBs检测结果均呈阴性。讨论结果表明，小鼠肌注NV-HB/s后2周，外周血中抗-HBs即已阳转，此后随时间延长，检出率进一步增高，至接种后1月起检出率即已达100%。外周血抗HBs阳转于接种2周后才逐渐出现，提示疫苗质粒注入小鼠后，进入肌细胞内并表达HBsAg需要一定时间。由于操作手法及小鼠个体间差异的影响，小鼠产生抗HBs的时间互

12、有先后，但阳转率逐渐增高，至接种后1月即已全部阳转，表明本实验所用疫苗质粒表达效率较高。然实验中所有肌肉标本原位杂交检测疫苗质粒DNA的结果均为阴性，提示核酸疫苗注射后存留于局部的质粒DNA拷贝数并不多，仅能被检测灵敏度极高的Southern吸印杂交技术所检出。接种后6月检出率降至25%，接种后4月部分标本中的质粒已低于Southern吸印杂交的检测下限，提示注射于接种局部的疫苗质粒随时间的延长而逐渐被清除，接种量的大部分可能系被宿主体内的核酸酶所降解。Davis等3观察到，在用100 mg剂量pCMV-S质粒接种时，肌注部位每3000个肌细胞中仅有1015个被质粒DNA所转染，且转染阳性细胞内的质粒拷贝数亦较低，与我们的结果相吻合。此外，结果显示肌注NV-HB/s后3天至6月检测局部组织中的C-myc mRNA均为阴性，表明在观察期限内，疫苗质粒DNA的注入并未见癌基因C-my