发酵过程优化原理

1、发酵过程优化原理第一节 发酵过程优化的微生物反应原理一、概述微生物是发酵工业的灵魂，对微生物控制的发酵过程进行优化，首先要了解微生物的生长反应特性。微生物细胞生长是细胞个体内许多化学反应的综合结果。这些反应包括合成提供其它反应需要的吉布斯自由能；利用底物合成结构单元，再聚合成大分子物质，供合成细胞所需等。正常情况下，微生物细胞为了确保有序和高效生长，必须将这些反应有机地结合在一起，经济地分配胞内各代谢途径的通量。大肠杆菌是发酵研究中用得最多的微生物。在大肠杆菌生长过程中前人已观察到下列现象 (1)在大肠杆菌快速生长期间，生物合成的中间体很少渗漏到胞外培养基，结构单元(氨基酸、核酸等)的合成速率

2、和聚合形成大分子的速率相一致； (2)大肠杆菌胞内的大分子物质随比生长速率而变化。细胞以高的比生长速率进行生长时对蛋白质的需求很高，因此相对于低的比生长速率来说，蛋白质合成系统(PSS)是细胞量中较大的部分。在低比生长速率下，PSS的利用率很低，其合成和维护对微生物来说是无用的代谢负担； (3)当生长培养基中的结构单元足够时，细胞就不再合成这些物质； (4)特定的代谢途径代谢特定的底物，只有底物存在时，细胞才合成相应的酶。如只有当乳糖存在时，大肠杆菌才合成b-半乳糖苷酶将乳糖降解成半乳糖和葡萄糖； (5)假如两个不同的底物同时存在于培养基中，细胞先合成能在一种底物上以较高比生长速率生长的酶系，

3、当这种底物消耗完毕，再合成利用另一底物的酶。如大肠杆菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长，首先代谢葡萄糖，此生长阶段不产生b-半乳糖苷酶，不能代谢乳糖。当葡萄糖浓度变得很低时，系统合成b-半乳糖苷酶并利用乳糖继续生长。 以上观测结果对其它微生物也具有一定的适用性。由于微生物胞内代谢途径紧密结合，因此，对全部过程进行建模(如对特定微生物的生长和产物形成)，并不需要对所有独立的反应都要详细描述。如对微生物生长建模时，通常将所有的代谢途径混合起来用几个单一反应来表示，有时甚至用一个反应式就可描述全部的生长过程。本节主要讨论微生物生长反应的基本原理。二、微生物生长反应细胞生长过程可分为三个步骤：(1)底

4、物传递进入细胞；(2)通过胞内反应，将底物转变为细胞质和代谢产物；(3)代谢产物排泄进入非生物相(胞外培养基)。培养基中存在的底物都是化学物质，可以被细胞摄入并代谢掉，或转化为其它细胞生长所需要的物质。有些代谢产物还可以作为二次底物被细胞利用，所以很难将这些物质归类为底物或是产物。例如，酿酒酵母的二次生长现象。当酵母以葡萄糖为底物进行生长的同时还产生乙醇。葡萄糖消耗完毕，细胞可以继续以乙醇作为底物进行生长。根据大肠杆菌生长过程中观察到的五种情况进行类推，当培养基中存在葡萄糖时，细胞不产生代谢乙醇的酶。因此可以观察到，在利用葡萄糖生长和利用乙醇生长过程之间有一个滞后的阶段。在本书中，只有最初存在

5、于培养基中的底物才被认为是底物。如上所述，葡萄糖是底物，而乙醇则是代谢产物。细胞质成分是由底物形成的、不能穿过细胞膜的物质。众所周知的细胞质成分有蛋白质、RNA和DNA，而一些小分子如ATP、NADH以及NADPH也可以归为细胞质成分。代谢产物是那些形成于胞内，能够穿过细胞膜的物质，它们可以被排泄进入非生物相。因此，代谢产物既可以是底物经过多步反应形成的小分子物质，也可以是细胞产生的大分子物质，如胞外蛋白酶。基于以上的讨论，本书对底物、代谢产物和细胞质成分的定义为：底物是一种存在于初始非生物相或者摄入物中起作用的可交换的化合物；代谢产物是一种作为代谢物产生于某代谢途径进入非生物相的化合物；细胞

6、质成分是一种细胞利用底物产生的不可交换的化合物。以下分别对运输过程(底物的摄入和产物的分泌)和胞内反应过程进行讨论。(一)运输过程 大多数细胞的细胞质外包围有两种结构：细胞壁和细胞膜。这些结构是细胞的屏障，其化学成分是允许非生物相和细胞质之间物质运输的决定性因素。细胞壁是一种具有交联肽聚糖的坚固结构，其主要功能是为了防止因胞内高的渗透压而引起细胞破裂。细胞膜主要由磷脂组成，在细胞生长过程中，具有变化的流动结构。大部分小分子很容易通过细胞壁，因此运输过程主要决定于细胞膜。大分子物质只有在细胞具有特定的排泄机制时才可以通过细胞壁。 革兰氏阳性菌(如乳酸杆菌)的细胞壁约厚35 nm，要比革兰氏阴性菌

7、(如大肠杆菌)薄2 nm左右。但是革兰氏阴性菌具有两层磷脂分子膜，其中一层位于细胞壁外。胞外的膜含有蛋白质，能形成足够大孔径的通道，确保分子量大到800900的分子自由进出。这些充满水的通道用于小的亲水分子通过细胞膜的快速扩散，因此胞外膜就起分子筛的作用。大分子物质只有在一些特殊的情况下，才能由专门的转运蛋白运输到细胞内部。然而一些重要的化合物(如糖、氨基酸和多数代谢产物)可以自由扩散进出胞外膜，因此对于革兰氏阴性菌来说，其细胞膜的特性决定着物质进出细胞的运输过程。 细胞膜由于胞内的渗透压而紧挨着细胞壁，但是革兰氏阴性菌和酵母细胞的细胞膜和细胞壁之间通常还有一层，即周质体空间。该层支持着204

8、0%的细胞质量，含有多种蛋白质，如蛋白酶、核酸酶和磷酸酯酶等水解酶。在周质体空间可发生许多反应，这使得从胞外培养基到细胞质的运输过程变得非常复杂。周质体空间最主要的功能就是以所谓的“结合蛋白”的形式富集底物，这可能与通过细胞膜的运输过程存在联系。因此，非生物相和周质体空间的底物浓度不一定相同，在对运输过程建模时必须考虑这些问题。 由于细胞膜是胞内和胞外环境的重要屏障，所以在细胞膜上的运输过程是研究者普遍关心的内容。目前的研究表明在膜上可能存在三种不同的运输机制：(1)自由扩散；(2)协助扩散；(3)主动运输。前两种机制是沿着浓度梯度进行运输，它们是被动的过程，在运输过程中不需要提供外部能量。而

9、主动过程逆着浓度梯度进行运输，需要输入相当量的吉布斯自由能。表2-1-1总结了一些底物和代谢产物在细菌和真菌中的运输过程。可以发现大多数底物在这两种微生物中以相同的方式进行运输。以下分别介绍三种运输过程的特征。表2-1-1 微生物体内不同底物和代谢产物的扩散过程化合物细菌真菌氨基酸葡萄糖乳糖甘油乙醇乳酸乙酸二氧化碳氧气水主动运输主动运输主动运输自由扩散，协助扩散自由扩散主动运输和自由扩散自由扩散自由扩散自由扩散自由扩散主动运输协助扩散和主动运输协助扩散和主动运输自由扩散，协助扩散自由扩散自由扩散自由扩散自由扩散自由扩散自由扩散1、自由扩散底物自由扩散通过脂膜包括三个步骤：(1)底物从胞外培养基

10、运输到膜相；(2)分子在脂膜中扩散；(3)从脂相进入细胞质。一般情况下，细胞质具有和胞外培养基相似的物理和化学性质，因此，步骤(1)和(3)相似。另外，相内的过程可认为处于平衡，也就是说这些过程的特征时间要比分子扩散通过脂膜层的特征时间短得多。界面上脂膜层物质的浓度可认为是水相中产物的浓度，分配系数Kpar就是化合物在脂层的溶解速率和在水中溶解速率的比值。分子扩散的质量通量遵守Fick第一定律，化合物通过厚度为dmem的质膜进入细胞的传质速率可以用方程(2-1-1)表示。(2-1-1)式中，Dmem为化合物在质膜中的扩散系数，ca和cb分别为非生物相(胞外培养基)和生物相(细胞质)中化合物的浓

11、度。DmemKpar/dmem的比率又称渗透系数P，经常用于传质的计算。如果缺乏一独特的渗透系数，可以通过式(2-1-2)进行粗略的估计。(2-1-2) 式中，Mw为化合物的分子量，为化合物在橄榄油水体系中的分配系数，P的单位为cm/s。通过大量不同化合物的测量，已经得到了它们之间的相互关系式。然而在使用该关系式时，有些化合物的P值可能会偏离方程预测值 如果定义acell为细胞的比表面积(m2/g干细胞)，那么化合物的比运输速率为(2-1-3)对于球形细胞来说，含水率为w(g/g)，细胞密度为r(g/m3)，则比表面积为通过自由扩散进行运输的重要化学物质有氧气、二氧化碳、水、有机酸和乙醇等。在

12、电离状态下，小分子有机酸在脂膜中实际上是不溶的，此时应当用膜两边的非电离有机酸的浓度来代替方程(2-1-1)中的总浓度ca和cb，这些浓度可通过式(2-1-4)计算得到:(2-1-4)式中，Ka为酸的电离常数。可以看到，膜表面水相的pH值对ci,undiss有影响，由于通常胞内外的pH不同，尽管ca=cb，理论上一定流量的酸通过膜是有可能的。尽管有机酸能迅速达到电离平衡，同时，在水相和脂相中未电离的酸也产生溶解平衡，水相中靠近脂膜的地方仍然有可能存在一薄膜层。假如胞内的酸浓度比胞外培养基中高得多，那么未电离的酸就持续移入脂膜，促使电离平衡向未电离形式移动，这样多数酸就溶解在脂膜中。在膜的培养基

13、这边，未电离酸的浓度很高，快速电离促使脂相中的未电离的酸进入水相。这样，我们可以利用方程(2-1-1)模拟小分子有机酸的情况，只有当假设的膜层不合理时，才需要修正膜内的pH差异。为了更好地理解自由扩散的意义，让我们来看一下乳酸的分泌过程。乳酸菌从葡萄糖转变为乳酸的过程中获得吉布斯自由能。为了保持胞内的pH不变，细胞必须将代谢产物乳酸排泄进入非生物相。乳酸的渗透系数大约为1.5×10-4cm/s。乳酸菌是直径约为1 mm的球形细胞，含水量80%，细胞的密度106 g/m3，因此细胞的比表面积为30 m2/g干重，代入方程(2-1-3)，得到rlac=(1.5×10-6 m&#

14、215;s-1×30 m2/g干重)(ca-cb)=(4.5×10-5 m3×s-1/g干重)(ca-cb) (2-1-5)在细胞的快速生长阶段，乳酸的产生速度大约为1.4 mg/(g干细胞×s)。由方程(2-1-5)可知，如果胞外培养基和细胞质之间的浓度小至31g m-3时，扩散过程就可以将产生的乳酸转移出细胞。乳酸通过脂膜的快速扩散还可以解释多数细菌体内乳酸(和其它小分子有机酸)的毒性效应。胞外乳酸浓度高时，胞内的浓度也很高。由于乳酸的电离常数很小，细胞很难维持胞内最适pH在7左右。尽管存在乳酸的主动运输系统，但通过细胞膜的快速自由扩散导致乳酸的连续

15、流入，随后细胞就不再消耗排泄乳酸所需的能量。2、协助扩散细胞膜中有许多转运蛋白，允许特定的化合物进行被动运输，但是要比自由扩散通过细胞快得多，这一过程就是协助扩散。对于真菌来说，这种运输机制是很典型的，在细菌中则比较少见，文献报道中只有甘油是通过协助扩散进入大肠杆菌细胞的。协助扩散与自由扩散相似，因为只有存在浓度梯度时，才发生由高浓度向低浓度的运输。化合物只有在自由转运物的存在下才能进入细胞，因此运输过程的速率遵循典型的饱和型动力学，如在低浓度下，运输速率与底物浓度呈一级相关，而在高浓度时则呈现零级相关。真菌中通过协助扩散的重要底物有葡萄糖和其它糖类。 离子可以通过细胞特定蛋白(类似于革兰氏阴

16、性菌细胞外膜的porin)形成的孔道而被摄入。当离子进入到孔道，内部就形成一种电荷，这可以防止其它离子进入。因此离子孔道和转运蛋白具有相似的功能，可以发现通过离子孔道的运输也遵循饱和型动力学。 3、主动运输 主动运输与协助扩散的相似之处为，两者都以特定的膜内蛋白作为运输过程的媒介。与协助扩散相比，主动运输可以逆着浓度梯度的方向进行运输，因此是一个耗能的过程。运输过程中需要的自由能可以靠消耗ATP中的高能磷酸键来维持(一级主动运输)，或者和其它沿着浓度梯度方向的运输过程结合在一起(次级主动运输)。对于有些底物存在一种特别的主动运输过程，即所谓的基团移位，它是指底物在穿过细胞膜时，转变成不可渗透的

17、异构体。 在氧化磷酸化过程中释放质子就是一个重要的一级主动运输过程。原核生物将质子释放到胞外培养基，例如穿过质膜而泵出体外。而在真核生物中，氧化磷酸化发生在线粒体内，质子穿过线粒体内膜而运输到线粒体内膜和外膜之间的空间里。在这两种情况下，质子的泵出是通过氧化NADH而释放大量的自由能来推动的。质子穿过膜的排出过程中会产生电化学势，将质子运输回细胞(或线粒体内)，就可以获得吉布斯自由能。质子的内流是靠参与了ATP合成的ATP酶传递的。质子的运输是可逆的，如ATP酶也可以通过消耗ATP的方式将质子泵出细胞，这也是一个一级主动运输过程。质子的运输过程如图2-1-1所示。图2-1-1 质子的运输 次级

18、主动运输是指在消耗已建立的其它物质梯度的基础上运输物质穿过细胞膜。如果这两种底物沿着相同的方向进行运输，过程就叫同向转移；若两种底物沿着相反的方向进行运输，过程则叫反向转移；如果电化学势驱动离子进行运输，则叫单向转移。一般情况下，次级主动运输是和穿过细胞膜的pH梯度相耦合的，为了保持胞内pH稳定，有必要通过ATP酶将质子泵出细胞。由于该过程需要能量，宏观表现就是次级主动运输过程需要胞内能量。次级主动运输的例子有：微生物通过透性酶摄入糖类。在这个过程中，糖和一个质子结合在一起运输到细胞质中，即质子同向运输；此外还有大肠杆菌中的乳糖透性酶系统。研究者发现在乳糖质子运输过程中，两种物质的化学计量比为

19、1:1。在其它运输过程中尚未发现到类似的简单化学计量比。基团移位是主动运输过程的一个重要方面。在该过程中，运输过程是和被运输底物的并发转变耦合在一起。最为人熟知的基团移位的例子是磷酸转移酶系统(PTS)，一些细菌用该系统来摄入不同的糖类。在这个系统中，糖类在被运输之前先被磷酸化，磷酸基团由EMP途径的中间体磷酸烯醇式丙酮酸提供。至少有4种蛋白参与磷酸基团的转移(见图2-1-2)，其中反应链的最后一环同时用作运输糖类穿过细胞膜的转运蛋白。反应链中的后两种蛋白对于特定的糖来说是特异的，而前两种蛋白在不同的PTSs中都是相同的。葡萄糖在PTSs运输下进入细胞时，直接被转化为6-磷酸葡萄糖(G6P)。

20、这样PEP中的高能磷酸键就得以保留，因此从能量的角度来看，这种摄入葡萄糖的过程要比通过透性酶摄入葡萄糖经济得多。此外，和其它的摄入系统相比，PTSs对糖类的摄入具有很高的速率。这可以用来解释为什么PTSs主要存在于发酵性细菌中，其中从糖代谢生成ATP的量比呼吸性细菌少，如严格好氧菌Azotobacter中不含有PTSs，而厌氧菌和兼性厌氧菌如乳酸菌属和埃希氏菌属拥有针对几种不同糖的PTSs。丝状真菌和酵母也不含PTSs。图2-1-2 某些细菌中用于摄取糖类的PTS图解(二)胞内反应 底物运输进入细胞质后，要经过1000多步不同的胞内反应转化成代谢产物和生物量成分，这些成分在大小和功能上存在差异

21、，但是90%以上的细胞物质都是由蛋白质、RNA、DNA、脂类和碳水化合物等大分子组成。大分子物质是通过底物的合成代谢反应而形成的，底物首先转化为氨基酸和核酸等结构单元，然后这些结构单元聚合成大分子。细胞的合成代谢活力取决于培养基的成分，当细胞在含有所有氨基酸的复杂培养基上生长，正常情况下不会再合成这些化合物。微生物的种不同，其生物合成能力也不同。有些微生物可以在只含有糖、无机氮和少量无机盐的培养基中生长，而有些微生物需要在含有一些结构单元的复合培养基上生长。合成代谢反应需要消耗吉布斯自由能和还原力，吉布斯自由能主要靠ATP中的高能磷酸键来提供，而还原力则由辅酶NADPH来提供。ATP中的高能磷

22、酸键水解可释放大量的吉布斯自由能：ATPH20ADPPDG0=-30.5 kJ/摩尔(2-1-6)式中，P表示磷酸基团。G为正的反应，可以通过水解ATP所释放的吉布斯自由能来起动。当NADPH被氧化成NADP+，释放两个电子，转移到细胞内其它化合物上使其还原。ATP和NADPH是在底物转化为能量更低的化合物的分解代谢反应中形成的，下面即对分解代谢和合成代谢作一介绍。1、分解代谢反应最常用于细胞生长的能源是糖类，它们在转化为代谢产物(CO2、乳酸、乙酸和乙醇等)的同时，还形成ATP、NADH和NADPH。其中NADH是和NADPH相似的一种辅酶。NADH和NADPH都在分解代谢反应中产生，但NA

23、DPH主要消耗于合成代谢中，NADH则主要消耗于分解代谢途径，如氧化磷酸化。大多数糖类在代谢之前都首先转化为6-磷酸葡萄糖(G6P)或6-磷酸果糖(F6P)。正常情况下，胞内的G6P和F6P处于异构平衡，G6P可以作为许多糖代谢反应链的起点。有些微生物中在运输葡萄糖的过程中形成G6P，但在另一些微生物中，G6P是通过胞内葡萄糖与ATP水解相耦合的反应而形成的。一般把糖从G6P开始的代谢分成酵解和丙酮酸代谢两个部分，酵解定义为从葡萄糖转化为丙酮酸所有途径的总和。在EMP途径中，G6P转化为丙酮酸，从葡萄糖开始的总的计量式如方程(2-1-7)所示。Glc2ADP2P2NAD+2PYR2ATP2H2

24、O2NADH2H+=0(2-1-7)F6P转化为1,6-二磷酸果糖的G为正，需要ATP水解提供能量才能进行。因ATP(或PEP)用于由葡萄糖形成G6P，故ATP的净产率是每摩尔葡萄糖转化为丙酮酸时产生2摩尔ATP。1摩尔葡萄糖经过部分氧化得到2摩尔丙酮酸所释放的四个电子，被2摩尔NAD+捕获形成2摩尔NADH。磷酸戊糖(PP)途径的主要作用是为合成代谢提供NADPH形式的还原物和合成核酸的前体物质5-磷酸核糖(R5P)。由于PP途径存在分枝点，对于需要R5P和NADPH的细胞来说，存在4种可能的化学计量式(表2-1-2)。表2-1-2 4种情况下PP途径的化学计量式情况化学计量式对R5P的需求

25、远大于NADPH5G6P5ATP6R5P5ADP4H2O4P对R5P和NADPH的需求平衡G6P2NADP+H2OR5P2NADPH2H+CO2对NADPH的需求远大于R5P，且G6P完全氧化为CO2G6P12NADP+7H2O12NADPH12H+6CO2P对NADPH的需求远大于R5P，且G6P转化为丙酮酸3G6P6NADP+5NAD+5P8ADP5PYR3CO26NADPH5NADH8ATP2H2O酵解途径形成的丙酮酸通过乙酰CoA的形式进入三羧酸循环(TCA)，并被完全氧化生成CO2和水。这里，1摩尔丙酮酸氧化可形成1摩尔ATP，4摩尔NADH和1摩尔FADH2。丙酮酸在TCA循环中被

26、完全转化的先决条件是，NAD+和FAD可以从NADH和FADH2中再生。该过程在呼吸链中发生，呼吸链是一个需要自由氧的氧化过程，因此只有在好氧微生物中才是可行的。在呼吸链中，电子从NADH通过NADH脱氢酶传递到辅酶UQ，再从辅酶UQ经过一系列细胞色素(含有亚铁血红素基团的蛋白)，最后传递给氧而形成水。细胞色素或辅酶UQ存在于细胞膜上或附近(或真核细胞线粒体的内膜)，当电子经过呼吸链，质子就通过膜层泵出细胞。当质子在ATP酶的作用下再进入细胞(或线粒体)，ADP就被磷酸化形成ATP，因此呼吸链通常也被称为氧化磷酸化。质子可以通过呼吸链上的3个位点泵过细胞膜。根据化学计量式可知，理论上1摩尔NA

27、DH氧化可形成3摩尔ATPNADH0.5O23ADP3P3H+ NAD+3ATP4H2O(2-1-8) 对于NADPH也有相似的反应，但是该辅酶主要用于生物合成。FADH2在UQ处进入呼吸链，因此电子不经过NADH脱氢酶。FADH2的氧化只导致质子在两个位点泵过细胞膜，化学计量式和方程(2-1-8)有所区别。FADH20.5O22ADP2P2H+ FAD+2ATP3H2O(2-1-9) 每个氧原子所形成ATP的摩尔数在氧化磷酸化中，通常称作P/O比，这个变量经常用于能量的计算，此处不作详细介绍。由方程(2-1-8)可以看出，如果NADH是代谢反应形成的唯一辅酶，理论P/O比率的值即为3，但是F

28、ADH2的P/O比率通常小于3。FADH2和NADH之比会随着操作条件而变化，因此P/O比也不是一个常数。 对于真核生物，情况可能更为复杂。NADH在细胞质中形成(酵解)，同时线粒体中也形成NADH。细胞质中形成的NADH不能穿过线粒体膜，它氧化为NAD+是和线粒体中FAD还原为FADH2的反应耦联进行的。细胞质中NADH在和FADH2同样的位置进入呼吸链，所以细胞质NADH氧化的理论P/O值只有2。为了计算总的P/O比率，有必要将细胞质中发生的反应和线粒体中发生的反应区分开来，由于这两种情况下形成的NADH的比率随操作条件而变化，所以通常不能指定P/O比率的值，除非知道理论值在23之间。由于

29、氧化反应和磷酸化过程不完全耦合，所以实际的P/O比率的值与理论值不同。 当氧化磷酸化失活(缺乏氧或必需的蛋白质)时，丙酮酸不能在TCA循环中氧化，否则将导致NADH在细胞内的积累。这种情况下，NADH被氧化的同时，丙酮酸可被还原为乙酸、乳酸或乙醇。这些过程统称为发酵性代谢。发酵性代谢并不是所有的微生物都一样，但有许多共同点。图2-1-3(a,b,c)揭示了两种细菌和一种酵母如何通过发酵性代谢来平衡EMP途径产生的还原力。如果乳酸是最终的代谢产物，所有EMP途径中利用的NAD+都可以再生。当乙醇是代谢产物时，就会形成NAD+过剩，不可能从葡萄糖中重新得到所有的碳，因为从碳元素的角度考虑，每摩尔葡

30、萄糖最多只能产生2/3摩尔乙醇，其它的碳转化为CO2或甲酸。形成乙酸时，NADH也过剩，同样可得出类似的结果。大肠杆菌的发酵性代谢中可形成图2-1-3中所示的代谢产物，因此，这种现象通常又称作混合酸发酵。大肠杆菌和乳酸菌的主要区别在于大肠杆菌缺乏在丙酮酸降解为乙酰CoA时生成CO2的能力。图2-1-3 Escherichia(A)，Lactococci(B)和Saccharomyces(C)在葡萄糖上的发酵性代谢 酵母中丙酮酸的代谢(图2-1-3-C)相则对复杂一些。TCA循环中化合物的代谢与合成是从乙酰CoA开始在线粒体中进行。为了使发酵代谢过程中细胞的氧化还原水平得以平衡，丙酮酸转变为乙醛

31、、乙酸和乙醇。值得注意的是，细胞质中在乙醛氧化成乙酸时会形成NADPH。最后，乙酸可通过乙酰CoA而被代谢掉(主要通过好氧生长)。酿酒酵母则既不产生乙酸也不产生甲酸，但可摄入乳酸并转化为丙酮酸。2、生物合成和聚合反应 为了合成细胞物质，需要合成结构单元并将其聚合。E. coli细胞中大约70%的能量和还原力被用于蛋白质的合成，微生物的种类和操作条件不同时，这一数值会发生很大变化。更深入的研究发现，细胞对于吉布斯自由能和还原力的需求取决于培养基中是否存在结构单元，因此，若细胞在只含部分结构单元的复杂培养基中生长，就很难对其进行详细的生理学研究，这也解释了优化培养基组成的困难所在。 由于合成蛋白质

32、需要消耗大量的自由能，因此细胞能否根据其自身需求来调节蛋白质的合成是很重要的。蛋白质的合成是通过蛋白质合成系统(PSS)进行的，该系统中核糖体是主要部分。细胞可通过调节PSS的大小和活性来控制蛋白质的合成，因此需要消耗能量。当细胞从能量充足的环境到缺能的环境，12 h内细胞就可调节PSS的大小来适应新的环境。考虑到PSS的重要作用，有理由将它的相对大小(g/g干重)作为结构模型中的关键变量。细胞合成所需要的结构单元数在75100之间，这些物质都是从12种前体代谢物合成得到的(表2-1-3)。可以发现，这些前体代谢物就是分解代谢反应的中间产物，因此分解代谢在细胞生长过程中起着双重的作用(为生物合

33、成提供能量和前体代谢物)。表2-1-3 合成E. coli细胞对前体代谢物的需求前体代谢物分子式摩尔质量(g/mol)需要量(mmol/g细胞)6-磷酸-葡萄糖C6H13O9P2602056-磷酸果糖C6H13O9P260715-磷酸核糖C5H11O8P2308984-磷酸赤藓糖C4H9O7P2003613-磷酸甘油醛C3H7O6P1701293-磷酸甘油酸C3H7O7P1861496磷酸烯醇式丙酮酸C3H5O6P168519丙酮酸C3H4O3882833乙酰辅酶A3747a-酮戊二酸C5H6O51461079琥珀酰辅酶A草酰乙酸C4H4O51321787 TCA循环的中间体用于生物合成会使T

34、CA循环活性降低，所以有必要补加这些化合物。丙酮酸羧化途径和乙醛酸循环是最重要的两条回补途径。在丙酮酸羧化反应中，草酰乙酸可由磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸合成；在乙醛酸循环中，异柠檬酸可转化为琥珀酸和乙醛酸，而乙醛酸可和乙酰CoA反应生成苹果酸。草酰乙酸和苹果酸的生成可保证TCA循环的持续运转。氮的同化也是细胞代谢很重要的一部分。在大多数合成培养基中，氨是用作氮源(氨也常作为复合培养基中的补充物)。氨通过结合进入谷氨酸或谷氨酰胺等氨基酸而被同化，如方程(2-1-10)和(2-1-11)所示。C5H6O5(a-酮戊二酸)NH4+NADHC5H9O4N(谷氨酸)NAD+H2O(2-1-10)C5H9O

35、4N(谷氨酸)NH4+ATPC5H10O3N2ADPPH+3、次级细胞代谢 细胞代谢和生长过程偶联在一起的过程，我们称之为初级代谢。但许多工业上重要的产品，其合成反应并不与生长过程偶联，我们称之为次级代谢，这些反应合成的产物叫次级代谢产物，就象初级代谢形成的产物叫初级代谢产物一样。次级代谢产物最典型的代表是抗生素。一般来说，所有细胞的初级代谢都是相似的，而次级代谢则随细胞不同而异。定义一个代谢产物是初级代谢物还是次级代谢物并不麻烦，但因为所有胞内反应都紧密相联，所以有时要对特定的代谢产物进行分类是有困难的。最早人们认为，只有与细胞生长过程中形成的才称之为初级代谢产物。乳酸是初级代谢产物，但它是

36、乳酸菌在非生长条件下形成的，许多其它的初级代谢产物也同样是在非生长条件下产生的，因此初级代谢产物定义为“在细胞生长所需要的反应中形成的产物”可能比较确切一些。与之相应，次级代谢产物就可定义为“在那些对于细胞生长不重要的反应中形成的产物”。根据这一，胞外蛋白(由插入的基因编码)也是代谢产物，但由于重组蛋白对于细胞功能不是必需的，因此不能称之为初级代谢产物，应当将这类产物归类为次级代谢产物。表2-1-4列出了一些重要的初级和次级代谢产物，其中大部分次级代谢物为抗生素。表2-1-4 一些工业上重要的初级和次级代谢产物一览初级代谢产物次级代谢产物乳酸青霉素乙醇头孢菌素CO2四环素乙酸链霉素柠檬酸短菌肽

37、谷氨酸氯霉素赖氨酸卡那霉素葡萄糖酸灰黄霉素核黄素赤霉素第二节 发酵过程数量化方法一、数量化方法的基础 如果把细胞看作是一个黑箱，忽略细胞内部的各种生化反应，仅考虑微生物和外界的营养和物质交换，可以得到深层发酵过程的宏观模式图，如图2-2-1所示。一般情况下，微生物生活在液相中，营养物Si(包括好氧过程中的氧)和产物Pj、CO2及反应热(Hv=容积反应热，J/L)均通过各相及其界面传递。在发酵过程中，传质限制性步骤可能包括4个方面(1)气液界面上的液膜；(2)液相主体；(3)液固界面上的液膜；(4)细胞壁和膜或固相细胞物质。图2-2-1 以液相中可观察的拟均相参数来表示的发酵过程原理X生物量；S

38、i底物；O氧；Pj、产物；C二氧化碳；Hv容积产热 发酵过程的数量化处理包括：(1)发酵过程的速度；(2)化学计量学和热力学；(3)生产率、转化率和产率。只有当变量可测量时，才有可能对发酵过程进行数量化处理。因此在实践中，要求方便、可靠和迅速地测量这些变量，特别是对发酵过程影响较大的关键变量进行准确测定。一般实验条件下能够检测的发酵过程参数如表2-2-1所示。表2-2-1 发酵过程常规的参数及其测量符号参数测量方法X生物量细胞干重，浊度，细胞数S底物酶法分析，化学法，色谱法P产物酶法分析、HPLC或特殊方法X氧PO专用电极分析C二氧化碳CO专用电极分析Hv发酵热温度、热平衡 对这样一个带有6个

39、变量的系统进行数量化处理，可基于带有化学计量系数ni的方程进行：(2-2-1) 这一方程常用于好氧、并产生CO的分批发酵过程。当然在有些情况下例外，如藻类生长时，利用CO2而产生O2。原则上讲，所有发酵工艺在较宽范围内都是自催化反应。这种催化由方程2-2-1表达。 对发酵过程进行数量化处理涉及很多数学符号，为便于理解，以下对本章即将出现的各种符号的数学含义进行解释。(1) 比生长速率(m)、比合成速率(qp、qc或qv)和比消耗速率(qs或qo)，与消耗速率(rs或r)或形成速率(rx、rp、rc、r)的概念是不同的。前者表示细胞的个体行为，反映了细胞的生长和代谢能力，是相对速度；而后者所表示

40、的则是细胞的整体行为，是绝对速度。(2) 省略了表示一阶微商的符号，用ri表示反应的绝对速度(ri)，ni表示物质的传递速度，q表示产热速度。(3) Y和ni分别表示产率系数和化学计量系数；K专门用于表征动力学方程的平衡、饱和或抑制常数。物质的浓度用小写字母表示，大写字母用于表征物质的量(X=x×V)。(4) 反应速度和传递速度的速度常数均用k来表示。带有n级反应的反应速度通常为：(2-2-2A) 反应速度常数kr取决于反应级数。传质速度为：(2-2-2B)式中DC为浓度梯度。传热速度为：(2-2-2C) 式中DT为温度梯度。kTR 和kHTR是表观传递系数，可用真传递系数(kL1、

41、kL2、kH)和相应的界面面积(aG/L、aL/S、aH)进一步解释。 表2-2-2和表2-2-3对发酵过程优化所涉及的动力学参数的概念进行了解释。表2-2-2 发酵过程的速度概念变量动力学参数物质传递热传递反应速度定义式包括单位g×L-1×h-1g×L-1×h-1kJ×L-1×h-1比反应速率定义式包括单位h-1速度常数定义式包括表2-2-3 发酵过程的化学计量学概念概念表示方法宏观化学计量学产率，包括微观化学计量学平衡常数K，包括Km、Ks、Ki二、发酵过程的速度 以最简单的分批发酵过程为例。当反应器容积VR恒定时，表2-2-1中

42、6种参数随时间的变化曲线如图2-2-2所示。其中可观测的参数有：菌体(X)的生长，底物(Si和O的消耗，产物(Pi、CO和Hv)的积累。在研究反应器内部物料平衡和过程动力学时，研究者最感兴趣的是这些参数变化的速度。图2-2-2 反应器容积恒定的分批培养中，发酵过程典型的浓度时间变化曲线S，底物；O，氧；X，菌体；C，二氧化碳；P，产物；Hv，热。 那么，如何构建速度方程呢?一般来说需要用质量守恒方程来进行推导或解释。这一方程主要含二项：(1)组分i被合成或消耗的来源和去向；(2)组分i通过单位表面积的物质流nI(mol×cm-2)。物质的流动nI=d(N/A)/dt，来自各种传递现象

43、，可用不同的术语来描述，例如流动速度v；通过浓度梯度的传导，即扩散D；分散作用Deff；或界面传递kTR。 方程(2-2-3)表示浓度ci随时间的变化。一般，方程可使用矢量符号写成(梯度=带方向坐标的偏微商)：(2-2-3A) 将各种传递项(，)分开，此方程可以以矢量的形式写成(2-2-3B)或以单维形式(如用于管状反应器)写成：(2-2-3C) 组分i形成或消耗的速度都是明显的变量(g×L-1×h-)，形成速度为正，消耗速度为负。对于非连续的搅拌罐反应器中物质形成或消耗的速度，方程.c，可简化成方程.d：(2-2-3D) 方程(2-2-3D)只有在T、VR为常数且理想混合

44、条件下才是正确的，该式仅代表一种组分形成或消耗的速度。 对于图2-2-2中T、VR为常数且理想混合的非连续反应器中的典型分批发酵过程，菌体生长速度为(2-2-4A) 氧和底物利用速度为和(2-2-4B) P、C和HV生成速度为，(2-2-4C)这些速度的单位是(g×L-1×h-)或(kJ×L-1×h-)，其数值可直接代入质量平衡方程。由于这些速度是绝对速度，不能代表系统的特征，为了对不同生物体或不同生物反应系统进行比较，需要用到物质产生或利用的比速率的概念。比速率是一个相对速度，它与生物量(以细胞干重表示)或有催化活性物质的量(如酶量)有密切的关系，一般

45、用式(2-2-5-AF)这一组方程来定义发酵过程中的各种比速率，其单位均为h-。生长的比速率为m(2-2-5-A) 或(2-2-5-B)式中n表示细胞数的比增加速率 底物消耗的比速率为qs(2-2-5-C) 对氧来说，(2-2-5-D) 产物形成的比速率为qp(2-2-5-E) 对CO2，(2-2-5-F)对HV，(kJ×g-×h-)(2-2-5-G) 以上比速率的定义类似于化学反应动力学中比速率的定义。化学反应动力学中非均相催化时，用活性催化剂的量MC给比速率下定义：(2-2-5-H) 均相催化时，则多使用反应器容积VR(V)定义比速率(2-2-5-I) 在某些情况下，也

46、可用其它量，例如催化剂的外表面积或固相的体积。 方程(2-2-5-H)和(2-2-5-I)中的i代表组分i的摩尔数(ci=iV)。将其代入方程(2-2-5-I)，就可将方程(2-2-5-I)和方程(2-2-4)的定义联系起来(2-2-5-K)当=常数时，方程(2-2-5-K)与方程(2-2-3-D)相同。 为了完整，方程(2-2-5-I)常被用作化学动力学中反应速度的定义。而真反应速度r则通过化学计量系数ni同上述生长或消耗速度(ri或ri)联系起来，(2-2-6) ni的符号遵循“消耗为负、形成为正”的原则。由于生物反应中的化学计量系数具有不确定性，故一般难以得到方程(2-2-6)中严格意义

47、上的反应速度。在进行生物反应动力学研究时，用的最多的是方程(2-2-5-A)(2-2-5-G)给出的比消耗或比形成速率。 发酵过程的自我催化性质可由方程(2-2-7)表示。(2-2-7)三、化学计量学和热力学(一)化学计量方程 对发酵过程进行优化研究，需要深入考察不同结构反应器中各种代谢反应的数量关系，研究所有与获取最大转化率(或产率)相关的因素，此时需要用到元素平衡原理。平衡可以分为宏观平衡和微观平衡。对在反应过程不发生改变的守恒物质只使用宏观平衡，而对非守恒物质还可使用微观平衡。化学计量学是关于化合物组成和化学反应转化率的数量化研究，与热力学、动力学一起构成反应工程学的基础。热力学只强调系

48、统的起始态和终止态，能给出关于反应可能进行到最大程度及热释放或吸收的信息；动力学主要涉及变化所需要的时间，可用于预测反应的进程；化学计量学则主要研究有关加工过程中反应组分组成的变化规律。 考虑到碳、氢、氧、氮元素的守恒，生物反应器中微生物细胞的活动可以用化学元素的平衡方程代替方程(2-2-1)来表示：(2-2-8) 式中，是通用化了的碳源，是根据元素分析得出的细胞组成，为产物。在特殊情况下，元素硫和磷也可以包括进来。方程(2-2-8)是活细胞内成百个代谢反应综合起来的总方程。不生成新细胞和产物的ATP系统和能量处理系统等代谢网内的许多循环和代谢链，都不影响总反应。因此，在使用总化学计量方程进行

49、宏观处理时，并不需要了解这些循环的详细情况，这样可使发酵过程的分析不太复杂，而又不失去重要的信息。 在生物反应中，原子守恒的一般形式是各反应的总和，由下式表示：(2-2-9)式中，n为化学计量系数，g为特定的元素。 然而，由于有数百种组分参与代谢，将方程(2-2-9)直接用于生物工艺的化学计量确实存在困难，但可以只将有限的几种化合物用在总生长化学计量方程中。理论上已证明这种方法是合理的。当复合反应处于稳态()时，可将方程(2-2-3)同方程(2-2-6)组合起来，写成和的形式：(2-2-10)这样，可以通过观察稳态时系统与环境之间的交流()来研究反应的化学计量学。当反应系统中没有产物净生成时，

50、有许多量被称为守恒量。这时的平衡方程没有产物生成项。 (2-2-11) 在稳态情况下，上述论据证实了可根据生长和产物形成的总化学计量方程来对微生物代谢进行处理。除了非开放反应器系统的定量化之外，把化学计量学用于发酵过程的主要问题来自代谢反应是个复杂的反应网络。对于简单反应，化学计量学价值不大；而要处理复杂反应，只能借助于用于复杂化学反应的数学方法。在这种情况下，必须建立元素平衡方程。由于这种方法太复杂，人们首先在生物工艺的定量化中使用了一种简单得多的方法使用产率系数的概念。(二)产率系数的概念 宏观产率系数(或称得率系数)Yi/j是化学计量学中一种非常重要的参数，常用于对碳源等底物形成菌体或产

51、物的潜力进行评价，其中i表示菌体或产物，j表示底物。Yi/j最初是由onod以质量单位和商的形式定义的：= (2-2-12) 根据这一定义，可以将消耗的量同形成的量关联起来，定量表示细胞或产物甚至热量的产率。产率的概念同样也能用于定量地表示不同消耗量之间或形成量之间的相互关系。表2-2-4对产率系数的定义进行了总结。表中质量组分的单位为(g组分i/g组分j)，有热量时的单位为(kJ/g组分j)。表2-2-4 生物反应过程中宏观产率系数的定义总览产率系数组分间的反应或关系定义YX/SSXYX/S=-rX/rSYX/OO2XYX/O=-rX/rOYP/SSPYP/S=-rP/rSYC/SSCO2Y

52、C/S= -rC/rSYP/OO2PYP/O= -rP/rOYHv/SSHvYHv/S=-rHv/rsYC/OO2CO2YC/O=-rC/rOYHv/OO2HvYHv/O=-rHv/rO 在某些情况下，以摩尔为单位表示产率系数更有利：(2-2-13) 异化过程中生成每摩尔ATP时增加的菌体质量，即对ATP生成的菌体产率YATP是研究生化途径分子能量学时的重要参数。微生物通过氧化底物，获得菌体合成、物质代谢、物质传递等生命活动所需的能量，但只有氧化反应中以生成ATP的形式获得的自由能，才能被微生物所利用，其余能量作为代谢反应热释放到环境中。根据这一观点，Bauchop以异化代谢中ATP的生长两作

53、为菌体产率的基准，定义(2-2-14)式中Ms为底物的分子量，YATP/S为相对于能源底物消耗的ATP产率，即每消耗1摩尔能源底物生成ATP的摩尔数。计算YATP，需要知道作为能源的底物的准确消耗量。在复合培养基上进行的厌氧培养，若培养基中所有碳源几乎都作为能源被分解，不转化为菌体成分，且只限于在底物分解过程中生成ATP时，ATP的生成、利用与菌体合成之间的关系如图2-2-3所示。图2-2-3 复合培养基厌氧培养过程中细胞的生物合成步骤及ATP的生成和利用YATP与微生物及底物种类无关，基本为一常数。在复合培养基的厌氧培养实验中观察到，不管微生物和环境的性质如何，YATP总是约为10.5。但该

54、值对微生物生长具有普遍性。在基本培养基中无论是厌氧还是需氧培养，单一碳源中一部分作为能源通过异化代谢分解，其余部分用于同化构成菌体。假设用于同化的这部分碳源与ATP生成无关，则对于异化代谢的碳源亦服从YATP10。 把相似的概念用于重要的常数和，可表达为(2-2-15)(2-2-16)值在实践中对推导元素平衡方程很重要，对与氧化磷酸化有关的理论问题也有重要意义。碳摩尔的概念可使产率以摩尔为单位来表达(2-2-17) 根据(2-2-17)的定义，可表示除了碳源和氧以外的底物的细胞产率。(三)产率系数与化学计量系数的关系 在方程(2-2-8)给出的通用化学计量方程的基础上，每种主要元素(C、H、O、N，省略S、P和灰分)都可写成下列平衡方程摩尔C(2-2-18-A)摩尔H(2-2-18-B)摩尔O(2-2-18-C)摩尔N(2-2-18-D)在方程(2-2-18-AD)中，生成碳摩尔细胞的底物()和NH3()的量可以直接测出。通过元素分析能测定细胞和产物的组成，得出a、b、g、d和a