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1、呫吨酮类化合物的合成及其与生物大分子的相互作用邹 兰 马 林 汪 波*基金项目 中山大学化学与化学工程学院第三届创新化学实验基金项目(批准号:02024)资助第一作者 邹兰(1980年出生),女,中山大学化学与化工学院应用化学专业99级指导老师 汪波 Email:ceswb 中山大学化学与化学工程学院,有机化学研究所 广州 510275摘要 合成了四个羟基呫吨酮类化合物,并通过紫外-可见光谱法初步研究了它们与-葡萄糖苷酶、酪氨酸酶、DNA三种生物大分子的相互作用。发现1,3-二羟基呫吨酮对-葡萄糖苷酶有显著的抑制作用, 1-羟基-3-(2-(1-哌啶)乙氧基)呫吨酮则在2.5×10-
2、5mol/L浓度下对-葡萄糖苷酶略有激活作用,并且能与DNA能产生相互作用。四个化合物均对酪氨酸酶有一定的的抑制作用,有关作用的机制和动力学研究有待进一步进行。关键词 呫吨酮类衍生物 -葡萄糖苷酶 酪氨酸酶 DNA 1 前言呫吨酮又叫二苯并-吡喃酮,它的衍生物广泛存在于自然界中,是药用植物的有效成分之一。由于呫吨酮类衍生物在其线形排列的三个环上具有酚性官能团,大多具有丰富的生物活性和药用价值,如抗菌活性、抗炎活性、抗氧化活性和抗肿瘤活性等1。化合物的生物活性一般和它们与生物大分子的相互作用如对某些酶活性的抑制作用或DNA的相互作用等密切相关的。因此,我们合成了四个有代表性结构的呫吨酮类化合物并
3、初步研究了它们对-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶两种酶的抑制作用以及与DNA的相互作用。结果发现1,3-二羟基呫吨酮5b对-葡萄糖苷酶有显著的抑制作用, 1-羟基-3-(2-(1-哌啶)乙氧基)呫吨酮6b则在2.5×10-5mol/L浓度下对-葡萄糖苷酶略有激活作用,并且能与DNA能产生相互作用。四个化合物均对酪氨酸酶表现出一定的的抑制作用,有关作用的机制和动力学研究有待进一步进行。2 实验2.1 材料和仪器a-葡萄糖苷酶、酪氨酸酶、小牛胸腺DNA、对硝基苯酚-a-葡萄糖苷、L-多巴购自Sigma公司;水杨酸、间苯二酚、间苯三酚、硫酸二甲酯、碳酸钾、PPA等均为市售分析纯试剂;N-氯乙基哌啶为
4、本实验室制备。化合物结构通过VARIAN UNITY INOVA-500核磁共振仪,VG ZAB-HS质谱仪,Bruker公司Equinox FT-IR 55红外光谱仪表征,熔点测定用毛细管法,温度计未校正。2.2 方法羟基呫吨酮的合成:1-羟基呫吨酮(5a):在50mL的圆底烧瓶中加入1.38g(0.01mol)水杨酸和1.11 g(0.01mol)间苯二酚,再加入15mLPPA,加热搅拌,在油温为180下反应4h。反应完毕后,将反应体系倒入正在搅拌的冰水混合物中,形成混浊溶液。过滤,并用乙酸乙酯萃取滤液,浓缩滤液,与滤渣合并,使用体积比为35mL:4d石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行柱层析分离
5、,得到浅黄绿色产物。熔点:140;文献值2:149;MS(FAB)m/z:213(M+H);IR(KBr)max(cm-1): 3424, 3083, 2923, 2853, 1648, 1611, 1478, 1460, 1376, 1285, 1234, 1047, 814, 768;1H NMR(CDCl3):12.64 (1H, s, 1-OH ), 8.28 (1H, dd, J = 2.0, 7.0 Hz, Ar-H ), 7.76 (1H, m, Ar-H ), 7.60 (1H, dd, J = 8.0, 8.5Hz, Ar-H ), 7.47 (1H, d, J = 8.0
6、Hz, Ar-H ), 7.40 (1H, m, Ar-H ), 6.93 (1H, d, J = 8.5 Hz, Ar-H ), 6.80 ( 1H, dd, J = 1.0, 8.0 Hz, Ar-H )。1,3-二羟基呫吨酮(5b)的合成: 称取1.38 g(0.01mol)水杨酸和1.28g(0.01mol)间苯三酚,反应及分离纯化步骤同5a,柱层析洗脱剂为体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯。得到产物 0.46 g,浅黄绿色,产率23;熔点:251-252 ;文献值3:256-258;MS(FAB)m/z:229(M+H);IR(KBr)max(cm-1):3330, 3078, 16
7、55, 1611, 1568, 1492, 1349, 1286, 1220, 1160, 826, 760;1H NMR(CD3COCD3):12.92 (1H, s, 1-OH ), 9.89 (1H, br, 3-OH ), 8.21 (1H, m, Ar-H ), 7.85 (1H, m, Ar-H ), 7.55 (1H, m, Ar-H ), 7.47 (1H, m , Ar-H ), 6.45 (1H, d, J = 2.5 Hz, Ar-H ), 6.28 (1H, J = 2.5 Hz, Ar-H )。 羟基呫吨酮衍生物的合成: 1-羟基-3-甲氧基呫吨酮(6a)的合成:在2
8、5mL的圆底烧瓶中加入45.6 mg(0.2 mmol)化合物5a和40.0 mg(0.3 mmol)硫酸二甲酯,用丙酮完全溶解,再过量少许,加入K2CO3粉末276.0 mg。加热搅拌,在油温70下回流4h,反应结束。过滤,浓缩滤液,使用体积比为35:1石油醚-乙酸乙酯进行柱层析分离,得到浅黄绿色产物。产率61.4;熔点:135;MS(FAB)m/z:243(M+H) IR(KBr)max(cm-1): 3450, 3067, 3001, 2923, 2851, 1659, 1604, 1569, 1466, 1318, 1294, 1158, 1076, 823, 793, 757;1H
9、NMR(CD3OD):8.20 (1H, d, J = 1.5, 8.0 Hz, Ar-H ), 7.80 (1H, m, Ar-H ), 7.51 (1H, dd, J = 0.5, 8.5 Hz, Ar- H ), 7.42 (1H, m, Ar-H ), 6.54 (1H, d, J = 2.0 Hz, Ar-H ), 6.34 (1H, d, J = 2.0 Hz, Ar-H )。1-羟基-3-(2-(1-哌啶)乙氧基)呫吨酮(6b):称取45.6mg(0.2 mmol)化合物5a和30.0 mg(0.2 mmol)N-氯乙基哌啶,按化合物6a步骤进行反应和分离纯化,使用体积比为10m
10、L:2mL:2mL:6d的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-氨水进行柱层析,得到黄色产物。产率58.4;熔点:114-116;MS(FAB)m/z:340(M+H) IR(KBr)max(cm-1):3450, 3092, 3064, 2930, 1659, 1605, 1569, 1466, 1317, 1291, 1173, 1076, 1038, 830, 785, 759 ;1H NMR(CD3OD):8.21 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, Ar-H ), 7.80 (1H, m, Ar-H ), 7.52 (1H, d, J = 8.5 Hz, Ar-H ), 7.43
11、(1H, m, Ar- H ), 6.58 (1H, d, J = 2.5 Hz, Ar-H ), 6.38 (1H, d, J = 2.5 Hz, Ar-H ), 4.27 ( 2H, t, J = 5.5 Hz, -OCH2 ), 2.88 (2H, t, J = 5.5 Hz, -CH2N=), 2.64 (4H, br, 哌啶2-H-) , 1.67 (4H, m, 哌啶3-H ), 1.52 (2H, m, 哌啶4-H ) 。呫吨酮类衍生物对-葡萄糖苷酶的抑制作用测定: 配制10mol/L的化合物5a、5b、6a和6b 溶液1mL。在1mL比色皿中加入30L浓度为0.6mg/mL的-
12、葡萄糖苷酶溶液和50L浓度为2 mmol/L的底物(对硝基糖苷)溶液,然后加入900L pH=6.8的磷酸盐缓冲溶液,再分别取20L浓度为10 mol/L化合物5a、5b、6a和6b溶液,总体积为1 mL,摇匀,在400nm下测其光吸收值,参比液用pH=6.8的磷酸盐缓冲溶液。比较同一条件下这四种化合物对-葡萄糖苷酶的抑制作用。 呫吨酮类衍生物对酪氨酸酶的抑制作用测定:配制5 mol/L的化合物5a、5b、6a和6b 溶液1 mL。在1 mL比色皿中加入20L 浓度为0.5 mg/mL的酪氨酸酶溶液和100L浓度为 20 mmol/L的底物(L-多巴)溶液,然后加入830L pH=6.8的磷酸
13、盐缓冲溶液,再分别取50L浓度为5 mol/L的化合物5a、5b、6a和6b溶液,总体积为1 mL,摇匀,在475nm下测其光吸收值,参比液用pH=6.8的磷酸盐缓冲溶液。比较同一条件下这四种化合物对酪氨酸酶的抑制作用。呫吨酮类衍生物与DNA的相互作用测定:在1 mL比色皿中加入5L、5mmol/L的6b溶液,然后分别加入0,50,150,300L的浓度为9.47×10-4mol/L的小牛胸腺DNA的pH=7.0的tris-HCl缓冲溶液。再加入相应体积的pH=7.0的tris-HCl缓冲溶液补齐至1mL。摇匀,在230-550nm下测其吸收曲线。同样依次测定5a、5b和6a与DNA
14、的相互作用。参比液用含有相应DNA浓度的pH=7.0的tris-HCl缓冲溶液。3 结果与讨论3.1 羟基呫吨酮的合成呫吨酮类化合物由于具有良好的生理活性,其合成受到广泛关注。2002年胡利红、覃章兰对经典的呫吨酮类化合物的合成方法进行了综述1,主要分为两步法和一步法两种。其中一步法常用2-羟基苯甲酸或酯与苯酚类化合物混合,在PPA、二苯醚、ZnCl2/POCl3作用下加热一步生成呫吨酮类化合物。本文采用一步加热合成法,以水杨酸和均苯三酚或间苯二酚为原料,PPA为催化剂合成了1-羟基呫吨酮(5a)和1, 3-二羟基呫吨酮(5b)。并对合成5b的反应条件进行了探索,提高反应温度有利于提高产率,1
15、40反应4h,产率仅为5.6%,180反应4h,产率提高到20%。同时我们尝试了微波条件下的反应,结果反应时间减少到7分钟,产率为23%。3.2 成醚反应呫吨酮类化合物的1-羟基和羰基与文献报道的一些抗肿瘤药物的活性中心具有类似结构,参考抗肿瘤作用的Cheng氏三点作用理论4,我们设计在3-羟基上引入含氮功能基,并与简单甲基醚形成对比。因此利用成醚反应,分别与硫酸二甲酯和N-氯乙基哌啶反应,合成了1-羟基-3-甲氧基呫吨酮6a和1-羟基-3-(2-(1-哌啶)乙氧基)呫吨酮6b。以上已合成的四个化合物的结构经过质谱(MS)、核磁共振谱(1H NMR)和红外光谱(IR)等得以确证。其中6b未见文
16、献报道。3.3 呫吨酮类衍生物对-葡萄糖苷酶的抑制作用:图1 呫吨酮类衍生物对-葡萄糖苷酶的抑制作用 将合成的四个化合物按照所述的方法进行-葡萄糖苷酶的抑制实验,以吸收强度对时间作图,如图1。实验结果表明化合物5b对-葡萄糖苷酶有较好的抑制效果,化合物5a和6a对-葡萄糖苷酶基本上没有抑制作用,其测量曲线与基线基本重合,而化合物6b对-葡萄糖苷酶有一定的激活作用。有关化合物5b和6b对-葡萄糖苷酶的抑制和激活机制将进一步进行研究和确证。3.4 呫吨酮类衍生物对酪氨酸酶的抑制作用:图图 2 呫吨酮类衍生物对酪氨酸酶的抑制作用目前发现的最有效的酪氨酸酶抑制剂例如曲酸、含羞成年碱等5,它们的结构都含
17、有相邻的羟基和羰基,根据所合成的四个化合物的结构,估计它们对酪氨酸酶应该也有抑制作用。将合成的四个化合物按照所述的方法进行酪氨酸酶的抑制实验,以吸收强度对时间作图,如图2所示。实验结果表明四个化合物对酪氨酸酶均有一定的抑制作用。关于它们的作用机制有待于进一步的深入研究。3.5 呫吨酮类衍生物与DNA的相互作用: 将合成的四个化合物按照所述的方法进行DNA的相互作用实验,以吸收强度对波长做吸收曲线。实验结果表明化合物6b与DNA能发生较好的相互作用,如图3。由图可看出,随着DNA浓度的增加,吸收曲线的峰值减小,说明化合物6b与DNA发生了相互作用,产生了减色效应,而且发生了一定的红移。可能原因是
18、化合物6b符合cheng氏三点作用理论,它含有羰基、羟基以及2-(1-哌啶)乙氧基三个结合点,而且含有芳香环大平面,可能与DNA发生作用。我们将会对它们的作用机制做进一步的研究。图3 化合物6b与DNA的相互作用致谢 本论文是在中山大学化学与化学工程学院第三届创新化学实验基金项目的资助下完成的,特此表示感谢。 参 考 文 献1 胡利红,覃章兰. 呫吨2 .Res., India,1954,13,B:3982-39854 古炼权,许家喜,段玉峰. 生物化学. 高等教育出版社,2000年7月第一版,第四章:酶化学,105页5 Shiino M.,Watanabe Y.,Umezawa K.Synthesie of N-substituted N-nitrosohydroxylamines as inhibitors of mushroom tyrosinase. Bioorganic & Medicinal Chemistry,2001,9,1233-1240Synthesis and interaction with biological molecules of xanthone derivativesZOU, Lan MA, Lin
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