实验一 DNA重组技术简介

1、现代美人鱼的诞生基因重组 1972年，美国斯坦福大学的Berg在 体外对猿猴病毒SV40的DNA和噬菌 体的DNA分别进行酶切消化，然后再 用T4 DNA连接酶将两种消化片段连接 起来，结果获得了包括SV40和DNA 的重组的杂交DNA分子。 1973年，斯坦福大学的Cohen等人 将编码有卡那霉素抗性基因的质粒与 编码有四环素抗性基因的另一种大肠 杆菌质粒重组后，得到了既抗卡那霉 素又抗四环素的重组体。 重组DNA技术 DNA Recombination Technique A 重组DNA技术的基本定义 1 基因工程的基本概念 A 重组DNA技术的基本定义 B 基因工程的基本定义 C 重组D

2、NA技术与基因工程的基本用途 重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因 与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物 体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表 达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为 分子克隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大 基本元件。 B 基因工程的基本定义 基因工程(genetic engineering 实现 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与 应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。 上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与 构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到 基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的 分离纯化过

3、程。 目的 分离获得某一目的基因或DNA 获得目的基因的表达产物（蛋白质） 基因克隆所用的方法及相关的工作，又称重组 DNA技术。 1 大规模生产生物活性物质 C 重组DNA技术与基因工程的基本用途 分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源 大规模生产生物活性物质 设计、构建生物的新性状甚至新物种 分 分 离 离 工 工 程 程 天然细胞 天然细胞 分离工程 分离工程 酶 酶 天然细胞 天然细胞 基因工程 基因工程 蛋白质工程 蛋白质工程 途径工程 途径工程 工程细胞 工程细胞 发酵工程 发酵工程 细胞工程 细胞工程 生物活性物质 生物活性物质 酶工程 酶工程 （二）工具酶 工具酶 重组DNA

4、技术中常用的工具酶 功 识别特异序列，切割DNA 催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3´末端 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸

5、基 能 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 Klenow片段 反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶 限制性内切酶基因的剪刀 限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease 识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其 周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。 Bam H GGATCC CCTAGG G + GATCC CCTAG G 2 连接酶基因工程的针线 （三）目的基因 cDNA (complementary DNA 基因组DNA (genomic

6、DNA （四）基因载体 定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达 有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 克隆载体(cloning vector 为使插入的外源DNA序列被扩增而特 意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector 为使插入的外源DNA序列可转录翻译 成 多 肽 链 而 特 意 设 计 的载 体称为 表达 载 体。 质粒 (plasmid 细菌染色体外 的小型环状双链 DNA分子。 二、重组DNA技术基本原理 目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 外源基因与载体的连接 重组DNA导入受体菌 特点: 能在宿

7、主细胞内独立自主复制；带有某些遗 传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 重组体的筛选 克隆基因的表达 3 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨 基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library 3. cDNA文库(cDNA library 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR 1. 化学合成法 2. 基因组DNA文库 组织或细胞染色体DNA 存在于转化细菌内 由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合 限制性内切酶 基因片段 克隆载

8、体 重组DNA分子 受体菌 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 含重组分子的转化菌 3. cDNA文库 mRNA 反转录酶 cDNA 复制 双链cDNA 载体 重组DNA分子 受体菌 cDNA文库 SI核酸酶 AAAA 逆转录酶 AAAA TTTT 4. 聚合酶链反应（PCR） 是一种在体外利用酶促反应大量获 得特异序列的基因组DNA或cDNA的专 门技术，又称为无细胞的分子克隆。 碱水解 TTTT DNA聚合酶 4 PCR的反应体系 模板DNA 引物 4种dNTP Taq DNA聚合酶 含Mg2+的缓冲液。 PCR的基本反应步骤及原理 （1）变性，加热至95 ，使模板DNA解开成单链； （

9、2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结 合； （3）延伸，温度升至72 ，DNA聚合酶以4种 dNTP为底物，在引物的3-OH上，合成与模板互 补的DNA新链。 PCR反应条件 （二）克隆载体的选择和构建 变性 95C （三）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 方式：(1同一限制酶切位点连接 (2不同限制酶切位点连接 延伸 72C 退火 Tm-5C 同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接 不同限制酶切位点的连接 GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam H切割 G CCTAG G CCTAG Bam H切割反应 Eco R切割位点 GATCC G 载体DNA用Bam H切割 GAATTC CTTAAG Bg l切割位点 AGATCT TCTAGA GAATTC CTTAA G AGATCT TCTAGA EcoR+ Bg l 双酶切 AATTC G A TCTAG Eco R+ Bg l AATTC G GATCT A 双酶切 + GATCC G GATCC G + AATTC G A TCTAG GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15ºC T4 D