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文档简介

1、张亚东 谭理 经过实验使学生掌握蛋白质浓度测定的三种方法的原理、实验步骤 了解改良lowry法、Coomassie亮蓝法、紫外分光光度法测定蛋白浓度的区别、优缺陷以及适用范围。 改良Lowry法 在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合，构成蛋白质-铜复合物。双缩脲反响 蛋白质分子中带有酚基的酪氨酸极易使酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸复原，生成钼蓝-钨蓝蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制规范曲线，测定样品中蛋白质含量。复原反响改良改良lowry法的原理图法的原理图650nm Coomassie亮蓝法 Coomassie亮蓝G250能与蛋白质的疏水区域结合

2、，这种结合具有高度敏感性，G250与蛋白质构成的复合物成蓝色，在595nm处有最大吸收峰，颜色深浅与蛋白质浓度成正比关系，经过建立规范曲线可测定未知蛋白浓度。 紫外分光光度法 有些蛋白质组成中常含有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm处有最大吸收峰，故可根据280nm处的吸光度的大小来测定这类蛋白质的含量。 在生物样品中还能够会含有核酸等成分，在280nm处也有吸收，它的最大吸收峰在260nm可经过阅历公式排除核酸的影响 蛋白质浓度1.45A2800.74A260 波长 260 280 改良改良Lowry法法编 号123456测定管蛋白含量ug/ml17.535701051400

3、未知标准溶液、样品ml1.01.01.01.01.0-1.0生理盐水ml-1.0-试剂Aml0.90.90.90.90.90.90.9 混匀后置于50度水浴中保温10分钟，冷却 室温放置10分钟 立刻混匀，置于50度水浴中保温10分钟，冷却后在650nm处比色试剂Bml0.10.10.10.10.10.10.1试剂Cml3.03.03.03.03.03.03.0改良改良Lowry法蛋白质浓度测定法蛋白质浓度测定制备规范曲线，根据测定管的OD650nm值计算未知蛋白质浓度 Coomassie亮蓝法亮蓝法管 号 123456测定管蛋白质含量ug/ml50025012562.531.250未知标准溶

4、液ml0.10.10.10.10.1生理盐水ml0.1样品ml0.1染液ml5555555制备规范曲线，根据测定管的OD595nm值计算未知蛋白质浓度 紫外分光光度法紫外分光光度法 取待测样品稀释液，以蒸馏水为对照，在紫取待测样品稀释液，以蒸馏水为对照，在紫外分光光度计上分别测定外分光光度计上分别测定OD280nm和和OD260nm的吸光度值，根据阅历公式计算蛋的吸光度值，根据阅历公式计算蛋白浓度白浓度 蛋白质浓度蛋白质浓度1.45A2800.74A260 比色法是常用的测定浓度的方法，其关键点在于规范曲线的制备一定要准确。规范样品的配置浓度能否准确直接影响实验的结果，因此要正确掌握加样枪、移液

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