HITS-CLIP步骤

1、第一天：1 细胞培养在100或150mm的平板上，用PBS漂洗，然后place in Stratalinker with the cover off。以400mJ/cm2照射一次和additional 200 mJ/cm2 in Stratalinker。2 收集细胞悬液，4下2500rpm离心细胞团5min，3(3x dry volume)倍细胞沉淀体积的PBS重悬细胞团，每个eppie加入1ml的细胞悬液，在4下快速离心，去上清，然后保存在-80备用（每管大约200µl细胞）。备注：1×HBSS：50ml 10×Hanks平衡盐溶液，Ca-Mg-free(Gi

2、bco, #14186-012)5ml 1M HEPES, pH7.3445ml ddH2O第二天：II免疫沉淀a 溶液（现用现配） 1×PXL （wash buffer） 1× PBS（组织培养等级tissue culture grade；不含Mg2+，Ca2+） 0.1% SDS 0.5% 脱氧胆酸盐 0.5% NP-405×PXL （高盐wash buffer） 5× PBS（组织培养等级；不含Mg2+，Ca2+） 0.1% SDS 0.5% 脱氧胆酸盐 0.5% NP-40 1×PNK缓冲液50 mM Tris-Cl pH 7.410

3、mM MgCl20.5% NP-401X PNK+EGTA Buffer50 mM Tris-Cl pH 7.420 mM EGTA0.5% NP-40b Bead的制备：每一Eppie的交联裂解液使用400 µl的蛋白A免疫磁珠(Dynal, 100.02)用pH 8.0的0.1 M的磷酸钠溶液洗小珠三次。（这里使用高pH是因为能增加蛋白A对抗体的结合。然而这需要所有免疫沉淀的缓冲液应该适用于你所用的抗体。例如，我们发现有些抗体在缓冲液中不与脱氧胆酸盐作用。）用350µl的pH 8.0的0.1 M磷酸钠重悬小珠，加入50 µl桥联Ab（2.4mg/ml；兔抗鼠I

4、gG）。在室温旋转试管45min；用pH 8.0的0.1 M磷酸钠洗三次。在400 µl pH 8.1的0.1 M磷酸钠溶液中重悬小珠，加入3 µl的2A8或12 µl的7G1-1*ascite液体（5mg/ml）。4°C下旋转试管4小时，1×PXL洗三次；如果你不准备加入交联裂解液，在最后一步移去小珠leave beads in last wash step。c RL3 (-P)接头（不含P磷）对5末端的标记。（在做IP之前或过程中制备5末端标记的接头。用预标记的3接头做AGO HITS-CLIP，发现在放射自显影图中比免疫沉淀后PNK反应标

5、记分离得到的RNA有更多特异性信号。）2.4 µl RL3(-P)接头(50pmol/µl；5端不含磷酸) 5 µl 10×PNK Buffer(NEB)25 µl 32P-ATP8 µl T4 PNK enzyme (NEB, M0201L)3 µl RNA酶 (Promega)6.6 µl water 50 µl total37°C时用Thermomixer R (Eppendorf)孵育30min。加入0.2µl的10mM的ATP，继续反应5min。旋转使树脂重悬在G-25柱子中

6、。事先以735g离心柱子1min，使样品混入树脂，735g旋转柱子2min。如果不打算立即使用，可以置于-20°C保存。d RNA的部分消化以及超速离心用700 µl 1×PXL（含蛋白酶抑制剂；总体积为1ml）重悬每管的交联裂解液；加入15µl的RNA酶(Promega)，置于冰上10min。每管加入30µl的RQ1 DNA酶，37°C孵育5min 1000rpm。在1×PXL中以1:100稀释RNA酶（高浓度RNA酶）在1×PXL中以1:1000稀释RNA酶（低浓度RNA酶）往两只试管中分别加入两种浓度的RNA

7、酶10µl；37°C孵育5min。30K for 20min at 4°C超速微量离心(polycarbonate tubes in TLA 120.2 rotor)裂解液。小心去上清，留下10µl做immunoblot实验。e 免疫沉淀把剩余的上清加入另一只新的含有bead的试管中。4°C旋转beads/裂解液混合物2-4小时。去上清，留下10µl做immunoblot实验（以确定抗原被除尽）。用冰的缓冲液洗beads：2x 1X PXL (Wash Buffer)2x 5X PXL (High-salt Wash Buffer )

8、2x 1X PNK Buffer【首次做CLIP实验对象应该是特殊的蛋白，可以跳过III-IV步,直接进行第V步。继续实验直到膜暴露在X-射线胶片上，检查以下问题是否存在：1. 在高RNA酶的实验中，蛋白的MW上是否有7kDa的放射性条带？2. 对照实验的条带是否不存在？对照组没有UV交联，含不相关的抗体，组织敲除，RNAi，或者没有转染标记的结构。3. 在低RNA酶实验中，这条带是否向上移动并且更加扩散？如果是，对RNA结合蛋白进行处理，可以在接下来的实验中继续步骤III。】【对含有低RNA酶（1:300,000）的样品继续步骤III。过渡消化的样品需要跳过III-IV步,保存在4°

9、;C直到步骤V。】IIICIP处理（on-bead）8 µl 10×去磷酸化脱磷酸缓冲液 (Roche, 712023) 3 µl 碱性磷酸酶 (Roche, 712023) 2 µl RNA酶 (Promega) 67 µl 水80 µl 总体积 37°C 在Thermomixer R (Eppendorf)中孵育20min（每两分钟1000rpm离心15s）。1X PNK Buffer 洗一次1X PNK+EGTA Buffer 洗一次1X PNK Buffer洗两次IVRNA 3接头的连接（on-bead）8 

10、1;l 10X T4 RNA ligase buffer (Fermentas) 8 µl BSA (0.2 µg/µl) 8 µl ATP (10 mM) 2 µl T4 RNA ligase (Fermentas) 2 µl RNA酶(Promega) 5 µl Labeled hot RL3 (12pmol, Prepared in IIc) 47 µl water 80 µl total把80 µl连接酶混合液加入含beads试管中。16°C 在Thermomixer R(Ep

11、pendorf)中孵育1小时（每两分钟1000rpm离心15s）加入4µl的RL3（20pmol/µl；5末端有磷酸盐），反应过夜。第三天 1X PXL buffer 洗一次5X PXL buffer 洗一次1X PNK buffer 洗三次V. PNK 处理(On-Bead)8 µl 10X PNK Buffer (NEB) 1 µl cold ATP (10mM)4µl T4 PNK enzyme (NEB, M0201L) 2 µl RNA酶 (Promega) 65 µl water 80 µl total

12、每份样品加入80µl的PNK混合液，37°C 在Thermomixer R(Eppendorf)中孵育20min （每4分钟1000rpm离心15s）1X PXL buffer 洗一次5X PXL buffer 洗一次1X PNK buffer 洗三次VI. SDS-PAGE以及硝酸纤维素转膜【western blot for input and post-IP；load equal volumes.】30 µl 1X PNK+和30 µl Novex 加样缓冲液（loading buffer）（不含还原剂）重悬beads。在10孔的Novex NuPA

13、GE 10% Bis-Tris 凝胶中每管液体加入到两个孔洞内，在冷室内，175V跑胶。跑胶完成后，使用Novex wet transfer apparatus将其转移至S&S BA-85硝酸纤维素膜上。在30V，用添加了10%的甲醇的NuPAGE Transfer Buffer转移1个小时。转膜完成后，用1X PBS冲洗硝酸纤维素膜，然后轻轻的印在Kimwipes上；用塑料膜包裹膜，暴露，放射自显影。第四天【因为Ago的存在，如果来自p13脑组织一半的neocortex作为起始原材料，我们能在暴露两个小时后的放射自显影图观察到一个信号。如果仅仅用到很少的材料，看到一个较弱的信号有时需

14、要过夜暴露。】不要从过度消化的样品中克隆RNA，但是可以用它确定接下来的步骤中的RNA-蛋白质复合体的特异性：1 观察过渡消化的样品，在可能出现的蛋白（100kDa）的MW的上部是否存在7kDa的条带。2 计算最近的污染条带的距离，以此确定相关的信号强度所对应的蛋白条带。3 如果你的蛋白条带相比其他的蛋白条带移动的距离超过10kDa，你应该确定纯化的RNA相对你的蛋白的特异性。被低浓度RNA酶消化的RNA-蛋白质复合体会表现出扩散的放射现象，跑胶时会出现在你的蛋白的MW的上部15-20kDa处。【因为Ago的存在，我们会观察到两种不同的模式。一种是Ago-miRNA复合体的110kDa，另一种

15、是Ago-mRNA复合体的130kDa。】4 长度为50个核苷酸的RNA的平均MW为16kDa。标签含有20个核苷酸的街头（L3），能够产生长于50个核苷酸的CLIP标签的蛋白质-RNA复合体的位置在蛋白的MW的上部20kDa处。5 因为RNA的消化是随机的，标签的大小为50-150个核苷酸不等，复合体的移动要比低浓度的RNA酶复合体更加分散（标签大小为20-60个核苷酸不等）。6 为了分离到不同蛋白特异的CLIP标签，需要把条带切得越细越好（3kDa宽的条带），大约在你的蛋白的MW的上部20kDa处。7 另外，切出两条在此条带上部和下部的条带，相距15kDa。下部的条带不含有你的蛋白特异的长

16、于15个核苷酸的任意RNA（但是要表明RNA能够结合任何小分子蛋白）。用干净的手术刀片切除细的条带（4-8kDa），把硝酸纤维素膜切片分别装入微试管中。切片越小越好。用闪烁记数器计算放射性。VIIRNA的分离和纯化1X PK Buffer: 100 mM Tris-Cl pH 7.5 50 mM NaCl 10 mM EDTA 1X PK Buffer/7M 尿素 (需要新鲜的): 100 mM Tris-Cl pH 7.5 50mM NaCl 10 mM EDTA 7 M 尿素用1X PK Buffer配制4mg/ml的蛋白酶K溶液；37°C预孵育20min以除去所有可能存在的RN

17、A酶。往每管分离的硝酸纤维素膜中加入200 µl蛋白酶K溶液；37°C预孵育20min at 1000rpm。加入200 µl 1x PK/7M尿素溶液；37°C继续孵育20min at 1000rpm。加入400 µl RNA phenol和130µl CHCl3到溶液中；37°C孵育20min at 1000rpm。【可以用0.15 M NaOAc pH 5.2平衡纯净的苯酚来配制RNA苯酚；氯仿：异戊醇=49:1配制CHCl3】微量离心机最大速度离心试管；取水相，加入50 µl 3M NaOAc pH 5.2

18、，0.75 µl的糖原和1ml EtOH：异丙醇=1:1。沉淀在-20°C过夜。第五天 IX RNA 5 接头的连接微量离心机最大速度离心RNA 10min。观察是否得到少量（decent）沉淀。冲洗并干燥沉淀。用闪烁记数器计算RNA。用5.9 µl H2O重悬。RNA ligation: 1 µl 10X T4 RNA ligase buffer (Fermentas) 1 µl BSA (0.2 µg/µl) 1 µl ATP (10 mM) 0.1 µl T4 RNA ligase (3U, Fer

19、mentas) 1 µl RL5 or RL5D RNA linker 20 pmol/µl 4.1 µl加入5.9 µl用H2O重悬的RNA。10 µl total16°C孵育1-5小时或过夜。往反应体系中加入：79 µl H2O11 µl 10X DNA酶 I Buffer5 µl RNA酶5 µl RQ1 DNA酶37°C孵育20min。加入300 µl H2O300 µl “RNA苯酚”100 µl CHCl3离心，取水相。加入：50 µ

20、l 3M NaOAc pH 5.2 0.5µl 糖原 (Ambion, 9510) 1 ml乙醇:异丙醇=1:1 使其产生沉淀。沉淀置于-20°C过夜或1小时第六天XRT-PCR离心RNA。冲洗并干燥沉淀。如果得到少量（decent）的沉淀，用闪烁记数器计算RNA。8 µl H2O重悬沉淀。RT反应体系：混合8 µl的连接RNA和2 µl的DP3（5 pmol/µl，终浓度为1 pmol/µl）以及3 µl 3 mM dNTPs。65°C加热5min，冷却并快速离心。加入：1 µl 0.1 M

21、DTT 4 µl 5X SuperScript RT Buffer 1µl RNA酶 1 µl SuperScript III (Invitrogen, 18080-044) 20 µl total50°C孵育45min，55°C 15min，90°C 5min，4°C保存。PCR反应：27 µl Accuprime Pfx Supermix (Invitrogen, 12344-040) 0.75 µl DP5 引物, 20 pmol/µl 0.75 µl DP3 引物,

22、20 pmol/µl 2 µl RT reaction 30.5 µl total设置：95°C 2min，25-35个循环（取决于刚开始RNA的量）：95°C 20s/58°C 30s/68°C 20s ，68°C5min。【每管两份。一份实验用，一份备用。】第七天 配10%的聚丙烯酰胺凝胶。我们使用Owl垂直电泳（P9DS-2）。每次配20ml：8.4 g尿素 (Fisher, U15-3) 5 ml 40% 19:1 Acrylamide:Bis-acrylamide (Fisher) 4 ml 5x TBE

23、 water to 20 ml total立即加入：200 µl 10% APS 和7.5 µl TEMED。我们使用2x 加样缓冲液（loading buffer）配制聚丙烯酰胺凝胶：95% 甲酰胺，去离子的 (Sigma F-9037)5% 100mM EDTA, pH 8溴酚蓝+二甲苯蓝(Sigma B-3269)开始PCR反应；使用小分子markers（我们用3 µl 的Amplisize Molecular Ruler，Biorad不能加热），把凝胶浸入用TBE稀释10，000倍的SYBR Gold中10min使DNA显影。Cut out 80-100n

24、t的DNA，用QIAquick Gel Extraction Kit抽提DNA（按照"user-developed"手册从聚丙烯酰胺凝胶中抽提DNA）。XIRe-PCR with Solexa Fusion PrimersPCR反应27 µl Accuprime Pfx Supermix (Invitrogen, 12344-040) 0.5 µl DSFP5 primer, 20 pmol/µl 0.5 µl DSFP3 primer, 20 pmol/µl 3µl RT reaction 31 µl total设置：95°C 2min，6-14个循环：95°C 20s / 58°C 30s / 68°C 40s68°C 5min2%的琼脂糖(琼脂糖凝胶或MetaPhor) / EB gel所有的PCR产物跑胶；小分子marker（5 µl Amplisize Molecular Ruler）。UV box观察DNA。Cut out DNA150-170nt，参照手册从琼脂糖凝胶中用QIAquick Gel Extraction Kit抽提DNA。XIIQuantitation of DNA用Quant-it D