人血浆中穿心莲内酯的HPLCMS测定及生物等效性研究

1、人血浆中穿心莲内酯的HPLCMS测定及生物等效性研究         09-08-24 15:03:00     编辑：studa20                作者：张志华，何周康，周彦彬，厉宇红，田娟，左英，丁劲松【摘要】  目的：建立人血浆中的穿心莲内酯的HPLCMS测定法，研究两种穿心莲内酯分散片的相对生物

2、利用度。方法：血浆样品液液萃取后，进行LCMS分析，色谱柱为汉邦C18柱（4.6 mm× 150 mm，5 m），流动相为甲醇水（7228，v/v），检测离子为m/z 373. 6（穿心莲内酯）、m/z 267.7（奈韦拉平，内标）。20名健康志愿者采用随机交叉方式分别单次口服穿心莲内酯分散片T或R各0.15 g，在不同时间点取血，样品以新建立的HPLCMS法测定，研究比较两制剂的药动学参数及相对生物利用度。结果：穿心莲内酯在1.343268.6 g/L浓度范围内与峰面积比线性良好，最低定量浓度为1.343 g/L。方法回收率为95.7%104.7%，日内RSD小于6.4%，日间RS

3、D小于12.4%。单剂量口服穿心莲内酯分散片T和R 0.15 g后两种制剂的Cmax 为（114.26±37.20）g/L、（107.95±32.44）g/L、；Tmax为（1.0±0.3）h、（1.1±0.3）h；AUC036 为（375.96±89.86）g·h/L、（368.84±89.14）g·h/L；AUC0为（388.39±91.14）g·h/L、（382.81±97.14）g·h/L；T1/2为（7.65±2.24）h、（7.90±2.16）

4、h。结论：该方法选择性好，灵敏度高，可用于穿心莲内酯的体内过程研究。药动学参数经方差分析表明，穿心莲内酯分散片T和R中穿心莲内酯的主要药动学参数之间差异均无统计学意义，双单侧t检验结果表明两制剂为生物等效制剂。 【关键词】  穿心莲内酯；HPLCMS法；生物利用度；生物等效性AbstractObjective: To develop an HPLCMS method to determine andrographolide in plasma and evaluate the bioavailability of andrographolide dispersible tablets

5、. Methods: Sample preparation was based on liquidliquid extraction. The compounds were separated on a Hanbon C18 column (4.6 mm×150 mm, 5 m) with mobile phase of methanolwater (7228, v/v) and analyzed by MS detector. Nevirapine was the internal standard and the target ions were m/z 373.6 for an

6、drographolide and m/z 267.7 for the internal standard. In a randomized crossover design, 20 healthy male volunteers were given 0.15 g andrographolide dispersible tablets T (test drug) or R (reference drug). The plasma samples were obtained and determined by the newlydeveloped HPLCMS method and the p

7、harmacokinetics and bioavailability were studied. Results: The calibration curve of andrographolide were liner within the range of 1.343268.6 g· L-1 with the limit of quantity 1.343 g·L-1, the methodology recoveries were in the range of 95.7%104.7%. Interday and intraday RSDs were less tha

8、n 6.4% and 12.4%, respectively. Pharmacokinetic parameters of andrographolide after a single dose of T and R were as following: Cmax were (114.26±37.20) g·L-1 and (107.95±32.44) g·L-1; Tmax were (1.0±0.3) h and (1.1±0.3) h; AUC0 36 were (375.96±89.86) g·h·

9、;L-1 and (368.84±89.14) g·h·L-1; AUC0  were (388.39±91.14) g·h·L-1 and (382.81±97.14) g ·h· L-1; t1/2 were (7.65±2.24) h and (7.90±2.16) h. Conclusions: The method is selective, sensitive and rapid for andrographolide determination. The res

10、ults of ANOVA analysis and two oneside t tests show that there is no significant difference between the pharmacokinetic parameters of the two formulations and bioequivalence is observed.Key wordsAndrographolide; HPLCMS; Bioavailability; Bioequivalence穿心莲内酯（Andrographolide）是从中草药穿心莲中提取的纯中药的有效单体，为穿心莲的主

11、要活性成分之一，在穿心莲中含量较高，且毒性最低1，是临床上应用有效的清热解毒、抗菌消炎药。但由于穿心莲内酯的水不溶性，单体穿心莲内酯较提取物在体内吸收差，血药浓度达不到治疗浓度而导致临床疗效不稳定，故将其加工为分散片以加大溶解度和溶出速率2。国内多采用HPLC法测定动物体内的穿心莲内酯的血药浓度36。由于仪器灵敏度的限制，难以满足该制剂在人体内的完整药时曲线的测定与药物动力学研究。本文采用HPLCMS联用技术，建立了简便、灵敏的体内分析方法，为穿心莲内酯的人体药代动力学研究提供可靠的检测手段，并以此法研究了两种穿心莲内酯分散片的相对生物利用度。1  实验部分1.1  仪器与

12、试剂    Waters ZQ2000液相色谱质谱联用仪（含二元高压泵、自动进样器、柱温箱、电喷雾离子化接口、2695液相色谱仪）；Masslynx 4.0高级色谱工作站；美国Millipore超纯水仪；METTLER电子天平；AllegraTM 64R Centrifuge台式高速冷冻离心机（BECKMAN COULTERTM）；旋涡混合器（上海分析仪器厂）。    穿心莲内酯对照品（天津市汉康医药生物技术有限公司提供，含量99.6%）；奈韦拉平（内标，南京第一医院提供）；穿心莲内酯分散片R（50 mg/片，江西青峰药业有限公司，批

13、号20050711）。穿心莲内酯分散片T（50 mg/片，天津市汉康医药生物技术有限公司试制，批号050324）。甲醇（色谱纯，TEDIA Company）；水为纯化水；其它试剂均为国产分析纯（AR级）。1.2 色谱条件及血样处理汉邦C18柱（4.6 mm×150 mm, 5 m）；柱温：25 ；流动相： 甲醇水（7228，v/v）；流速：1.0 mL/min分流进样。毛细管电压：3.50 KV；锥孔电压：35 V；干燥气流速：500 L/h；离子源温度：120 ；辅助气温度：380 ；离子检测方式：选择性离子检测（SIM）；离子极性：正离子（positive）；离子化方式：气动辅助

14、电喷雾离子化（ESI）；检测对象：穿心莲内酯，M+Na+，m/z 373.6；内标：奈韦拉平，M+H+，m/z 267.7。准确吸取血浆0.5 mL，置10 mL具塞尖底离心管中，加入内标（1.068 g/mL）100 L，漩涡振荡1 min，加入乙酸乙酯2.5 mL，漩涡振荡3 min，4 000 r/min离心10 min，吸取有机相于另一离心管中，50 水浴氮气吹干。残渣用150 L流动相溶解，进样20 L。1.3 试验方案    试验经中南大学伦理委员会批准，20名健康男性志愿者，年龄（22.2±1.4）岁，体重（58.5±5.7）kg，经签署知情同意书和体检合格后纳入试验。志愿者随机等分为两组，禁食12 h后，于清晨分别单次口服穿心莲内酯片T或R 0.15 g，于服药前及服药后0.25 h、0.5 h、0.75 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h、6.0 h，8.0