金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法的比较研究

1、 1468中国卫生检验杂志2008年8月第18卷第8期Chinese Journal of Health Laboratory Technology,Aug2008;Vol18No81.3培养方法将金黄色葡萄球菌株、单核细胞增生李斯特菌分别在平板上划线分离,挑取单菌落,接种于5ml LB液体培养基中, 37摇振(180r/m过夜培养(16h。1.4基因组DNA提取应用4种方法进行对比研究,每种方法所用菌量都相等(应用上述培养方法离心后收集菌体,加入TE(10mmol/L Tris.C1,1mmol/L EDTA,pH8.0悬浮菌体,制成菌悬液备用。方法1【l:取300肛l菌悬液,加入30出10

2、%SDS和3Ixl 10mg/ml蛋白酶K,55水浴1h;加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1混匀,离心取上清;加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1混匀,离心取上清;加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和2倍体积的冰的无水乙醇混匀,一20。C静置30min,离心去上清,沉淀用75%的乙醇洗涤,干燥,沉淀溶于50斗l双蒸水中,于一20保存。方法2¨:取300斗l菌悬液,离心,沉淀加入含10%蔗糖的TE缓冲液400一,然后加20mg/ml的溶菌酶20一,37。C,作用45min,再加入30txl,10%SDS和3山,10mg/ml蛋白酶K,55。C水浴1h;加入等体积的酚/氯仿

3、/异戊醇(25:24:1混匀,离心取上清;加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1混匀,离心取上清;加入0.1倍体积的3moVL NaAc和2倍体积的冰的无水乙醇混匀,一20静置30min,离心去上清,沉淀用75%的乙醇洗涤,干燥,沉淀溶于50止双蒸水中,于一20保存。方法3¨“:取300¨1菌悬液,离心,沉淀加500Ixl丙酮,混匀,冰浴5min,离心,弃上清,沉淀加入TE缓冲液210出, 20m#ml溶菌酶40斗l,37作用2h,再加入10%SDS20山,放置5min,煮沸5min,再加入TE150山、饱和酚200一、氯仿:异戊醇(24:1200“l,充分振荡混匀,离心,吸取

4、上清,加人等体积的氯仿/异戊醇(24:1混匀,离心取上清;加入0.1倍体积3moL/L NaAc和2倍体积的冰无水乙醇,置一20。C, 30min,离心去上清,沉淀用75%的乙醇洗涤,干燥,沉淀溶于50m双蒸水中,于一20保存。方法4¨5“o(改进:取300斗l菌悬液,离心,沉淀加入1止70%乙醇混匀后,0。C,静置20min处理后,离心,收集菌体,加入TE缓冲液共467山,20mg/ml溶菌酶12“l和1一RNase(1mg/m1,0。C1h,并间隔摇晃几次,取出放置一20, 20min,立即放入68水浴10min,加入10%SDS53山,680C 水浴15min,取出加入5m0L

5、/L NaCl87斗l,CTAB/NaCl(1% CTAB,0.73moL/L NaCl69以68水浴15rain,一20置30min,取出加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1混匀,离心取上清;重复上述步骤一次,加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1混匀,离心取上清;最后用2倍体积的冰的无水乙醇混匀,一20静置30min,离心去上清,沉淀用70%的乙醇洗涤,干燥,沉淀溶于50山双蒸水中,于一20保存。1.5金黄色葡萄球菌分离菌株、李斯特氏杆菌DNA提取采用上述4种方法进行,各种不同方法所用菌量相同,并进行3次以上平行提取。1.6DNA得率和质量检测DNA定量:通过紫外260nm处吸光值计算,各方法提

6、取DNA按1:100稀释,测260nm和280nm吸光值,DNA质量检测通过凝胶电泳、EB染色后紫外检测比较¨1。1.7PCR驴增应用金黄色葡萄球菌16S rRNA的保守序列设计一对引物(理论扩增长度565bp来评价所提取的DNA,引物序列:上游引物一5一GTGCACATCTrGACGGTACC一3,下游引物一5一CGAAGGGGAAGGCTCTATC一37。PCR扩增条件:95, 5min,95。C30S,4430S,72。C30S,35个循环,72。C,延伸8min。扩增产物4¨l进行电脉,EB染色,紫外观察,比较电泳图象。2结果2.14种不同方法提取的DNA结果与分析

7、通过多次平行实验表明方法1、2和4提取纯度较高, A260/280的值在1.82.1之间,方法3和4提取得率较高,但方法3纯度偏低,从图l可以看出,方法3DNA降解较多,其余3种方法DNA几乎没有降解,纯度较高。综合考虑纯度和得率,选择方法4为最佳提取方法(见表l和图1。表14种不同方法提取DNA得率的比较图14种不同方法提取DNA凝胶电泳图泳道M为DNA Marker,1、2、3为方法2提取,4、5、6为方法4提取,7、8、9为方法3提取,10、11、12为方法1提取,分别按菌株s6、S2和26111顺序上样2.2应用方法4分别提取三株金黄色葡萄球茵分离菌株、单核细胞增生李斯特菌DNA结果见

8、图2。图2应用方法4提取三株金黄色葡萄球菌分离菌株、单核细胞增生李斯特菌DNA凝胶电泳图A:三株金黄色葡萄球菌分离菌株的DNA; B:单核细胞增生李斯特菌的DNA中国卫生检验杂志2008年8月第18卷第8期Chinese Journal of Health Laboratory Technology,Aug2008;Vol18No82.3PCR扩增结果应用设计的16SrRNA引物对方法4提取的6株不同金黄色葡萄球菌进行PCR扩增,每种菌株都出现了很亮的条带(见图3,表明方法4提取的DNA可以用于分子生物学方面研究。图3方法4提取六株不同金黄色葡萄球菌PCR扩增结果3讨论(1对病原微生物来说,为

9、了提取相对完整和纯的基因组DNA,首先要理解病原细菌的分子特征、生理学和流行病学等特点。金黄色葡萄球菌为革兰阳性细菌,细胞壁较厚,葡萄球菌蛋白A是它细胞壁最主要的一种蛋白质,90%以上金黄色葡萄球菌都含有此蛋白,与细胞壁中的肽聚糖以共价交联形式形成致密结构,不同菌株之间含量有明显的差别,所以不同菌株的破壁难易程度也不一样。(2细菌DNA的提取通常采用化学方法,提取DNA时主要依赖溶菌酶并结合其它裂解脂类和蛋白质的酶,但是,金黄色葡萄球菌对溶菌酶具有抗性m1,与分枝结核杆菌和化脓性链球菌一样对溶菌酶不敏感,因为它们都具有复杂的细胞壁。方法4在DNA提取之前应用了70%乙醇处理细菌细胞¨

10、5”J,70%乙醇处理另一个作用是增加后来细胞对裂解液的敏感性,经过乙醇处理后的细胞,再用溶菌酶处理可被很好地消化。实验表明,经70%乙醇处理后提取的DNA质量更高、更好。(3本研究参考不同文献报道方法对金黄色葡萄球菌DNA提取得率和质量进行比较,并对方法4进行了部分改进¨“,使得提取的程序更为简洁,方便,方法3虽然提取得率最高,但DNA降解较多,降解的主要原因是1000C进行5min煮沸。方法4是一个适合较宽范围的病原细菌基因组DNA提取方法,采用16SrRNA的通用引物对所提取的DNA进行PCR扩增验证,证实了方法4提取的DNA对PCR扩增无任何抑制作用,适用于其它分子生物学基本

11、操作,方法4同样也适用于单增李斯特氏杆菌DNA的提取。综上所述,本研究为金黄色葡萄球菌高纯度DNA的提取找出了一种最好的方法,从而为金黄色葡萄球菌和其它病原菌基因操作和快速检测技术打下基础,有利于实验室快速分子诊断和流行病学的调查研究。参考文献1Franklin D,Lowy MD.Staphylococcus aureus InfectionsJ.N Engl JMed,1998,339(8:520532.2Schuenck RP,Lourenco MC,Iorio NL,et a1.Improved and rapid detection of methicillin-resistant

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