以异柠檬酸裂解酶为靶点筛选抗持留结核分枝杆菌药物

1、以异柠檬酸裂解酶为靶点筛选抗持留结核分枝杆菌药物         09-08-27 14:42:00     作者：肖春玲    编辑：studa20【摘要】  进入21世纪，结核病仍然是临床上发病率和死亡率最高的传染病之一。目前，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的多重耐药，以及在抗结核药物作用过程中结核分枝杆菌的持留状态，已成为全世界结核病控制工作的主要障碍。异柠檬酸裂解酶(isocitr

2、ate lyase，ICL)是乙醛酸循环途径中的关键限速酶之一，决定了结核分枝杆菌的持留性。在文中我们将描述异柠檬酸裂解酶的基本性质及结构特征，希望能通过对ICL抑制剂作用区域的了解来推动抗持留结核分枝杆菌药物的研究。 【关键词】  异柠檬酸裂解酶； 结核分枝杆菌； 持留状态    ABSTRACT  Getting into the 21st century, tuberculosis remains a leading cause of mortality worldwide. The main obstacles to the globa

3、l control of the disease are emerging multi-drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis and the recalcitrance of persistent infections to treatment with conventional anti-TB drugs. Isocitrate lyase (ICL) is a key rate-limiting enzyme in the glyoxylate bypass, and it is needed for persistent

4、 Mycobacterium tuberculosis to get energy. Consequently, isocitrate lyase is an attractive targets for the development of new antituberculosis agents. In this paper, the characteristion and structure of ICL were decribed. Our understanding of the inhibitor-bound sites will provide a springboard to f

5、ind drugs which target the tuberculosis infection.    KEY WORDS  Isocitrate lyase;  Mycobacterium tuberculosis;  Persistent infections    结核分枝杆菌的持留状态是治疗结核病的瓶颈之一。处于持留状态的结核分枝杆菌，其生长速度极为缓慢甚至不生长，以此来躲避抗结核药物的攻击。人体的免疫系统及现有的抗结核药物可以迅速杀死处于生长状态的结核分枝杆菌，但对于处在非生长状态的持留结核

6、分枝杆菌却无能为力。一旦患者的免疫力下降或停止用药，持留结核分枝杆菌将大量生长繁殖，重新处于活跃的致病状态1，2。这是全球防治结核病工作的主要障碍之一。因此，我们迫切需要研发出新型的抗结核药物，特别是对持留状态的结核分枝杆菌有杀灭作用的药物。此类药物的研制对缩短结核病的治疗时间，降低耐多药结核病的发生，减少结核病的复发和患者的再感染几率有着极为重要的意义。    近年来，研究学者在结核分枝杆菌的持留性发生和保持机制方面取得了一些进展，这些研究成果将对新型结核药物的研发有重要的推动作用。    1  持留结核分枝杆菌在巨噬细胞

7、中存活    不同于其他通过逃避吞噬而致病的细菌，结核分枝杆菌能通过多种机制，利用宿主细胞表面的多个受体(包括甘露糖受体、补体受体、和Fc受体)进入巨噬细胞，并在巨噬细胞内存活。研究显示，宿主细胞表面的甘露糖受体能选择性的结合结核分枝杆菌H37Rv毒株，并且该受体的表达能被干扰素下调，因此在结核分枝杆菌感染早期的摄入中可能发挥重要作用3。    巨噬细胞可以产生具有抗微生物活性的活性氧或活性氮，抵抗巨噬细胞的杀伤是结核分枝杆菌毒力的关键4。结核分枝杆菌有两种编码超氧化物歧化酶蛋白的基因sodA和sodC。sodA编码锰、铁超氧化物歧化

8、酶，它是结核分枝杆菌大量分泌的胞外蛋白之一。sodC编码铜、锌超氧化物歧化酶，其分泌量较少。超氧化物歧化酶(SOD)的功能是将O2-转变成分子氧和过氧化氢，消除O2-的毒性作用，并且可以通过其他反应防止大量过氧化氢的产生。SodA和SodC蛋白能帮助结核分枝杆菌防止超氧化物的毒性作用以及抵抗活性巨噬细胞呼吸暴发产生的氧化物的杀伤5。    Jun等观察到结核分枝杆菌的eis(enhanced intracellular survival)基因可以增强结核分枝杆菌在巨噬细胞内的存活能力。当eis基因受到损伤后，结核分枝杆菌在巨噬细胞中的细胞内生存能力大大降低，同时发

9、现eis基因只出现于致病性的分枝杆菌或是实验室中产生的工程菌，而不存在于其他为数众多的非致病分枝杆菌6。    2  异柠檬酸裂解酶与结核分枝杆菌在巨噬细胞内持续存活的关系    图1    异柠檬酸裂解酶催化反应3  异柠檬酸裂解酶的基本介绍    异柠檬酸裂解酶对于结核分枝杆菌在体内的持续感染至关重要，了解异柠檬酸裂解酶的某些基本性质，特别是能影响其活性的重要位点，将有效地推动以异柠檬酸裂解酶为靶点的抗结核药物的研发。   

10、; 3.1  表达条件    当向最低限度培养基中补充乙酸盐或棕榈酸盐时，结核分枝杆菌表达异柠檬酸裂解酶的水平将显著上调。学者们发现，不论培养基是以什么作为碳源，异柠檬酸裂解酶都可以实现低限度的表达9。    结核分枝杆菌表达ICL的水平与其对氧的利用率有直接关系，在通风条件下培养12周所表达的ICL总量比相同培养基相同时间内缺氧培养的结核分枝杆菌表达该酶数量明显减少。Wayne等观察到结核分枝杆菌在适应氧浓度较低条件生存时，其表达的ICL的酶活性有短暂的提升10。在宿主细胞内，结核分枝杆菌面对着无游离氧的缺氧环境，其氧呼吸

11、代谢关闭，启动乙醛酸支路获取能量。    3.2  结构特征    异柠檬酸裂解酶在细菌(Kornberg，1966)、古生菌(Serrano et al.，1998)、酵母(Taylor et al.，1996)、真菌(Lorenz and Fink，2001)以及高等植物(Eastmond and Graham，2001)中普遍存在。    在M.tuberculosis中由icl基因编码的异柠檬酸裂解酶是一个由428个氨基酸组成的含有四个亚单位的蛋白11，每个亚单位由14个螺旋和14个折叠

12、组成(图2、图3)。这一结构最显著的特征是亚单位螺旋之间的相互交换。这种交换在其他酶蛋白中可以保证稳定的二聚体的形成，并有利于产生显著的构象改变以便使其活性环状区域与底物相结合12。    这个蛋白的核心由8个螺旋(411)和8条折叠(25，8，1214)前后交错形成圆桶状结构。一个螺旋(12)处于8个折叠的后方， 这个    图2    异柠檬酸裂解酶四聚体结构图3    ICL四聚体亚单位结构    螺旋和另2个螺旋(13和14)与相邻的亚基

13、产生独特的相互作用。5个折叠(6，7，9，10，11)组成一个结构域，处于蛋白核心圆筒结构的上方，这个结构域包括了许多酶的活性位点区域。例如，一个紧邻残基Glu247的大约包括100160个氨基酸的序列位于这一结构域，此序列在许多植物表达的ICL中都存在，其功能可能与靶向作用于过氧化物酶体有关13。    上述-结构域中含有ICL的一个重要催化残基K189KCGH193，此残基位于一个可变型的环形模体中，可通过构象变化与底物相结合。K189KCGH193中含有亲核性的半胱氨酸(Cys191)，当酶与底物结合后，Cys191与底物相邻，并且与底物竞争结合位点，进而封

14、闭活性区域。    通过生物信息学的分析我们得知ICL蛋白可以分为两大类，他们以不同的长度和结构域组成而区分。第一类由小的真细菌类ICL蛋白组成，其中就包括结核分枝杆菌产生的异柠檬酸裂解酶。这一类的ICL蛋白含有结构域1、3，结构域1包括了保守的催化模体KKCGH。第二类由中等长度的植物以及真菌ICL蛋白组成，除了结构域1、3还包括第一类ICL蛋白所缺少的结构域214，15。    3.3  催化机制    异柠檬酸裂解酶将异柠檬酸的C-C键可逆地裂解，使异柠檬酸裂解为乙醛酸和琥珀酸。异柠檬酸裂

15、解酶的催化机制正是由这一裂解过程的逆反应所揭示的。乙醛酸首先深入ICL的活化位点区域并与之结合，琥珀酸再加入形成三重复合物。这一过程中关键的一个步骤是琥珀酸中质子的去质子化。K189KCGH193残基中的Cys191在邻近His193的协助下使亲核的质子从琥珀酸的第二个碳原子上脱离16。抑制剂与ICL结合后，这两个位点移动了5，这直接导致质子无法转移。至于C-C键是如何断裂的，还有待于进一步研究。    3.4  金属离子、pH对ICL酶活力的影响    在缺乏二价阳离子的情况下，经过纯化的异柠檬酸裂解酶只有极微弱的活性；然

16、而加入Mg2+或Mn2+后则恢复了酶活。培养环境中含有5mmol/L的Mg2+异柠檬酸裂解酶的活性最大，Mn2+被认为可以代替Mg2+，但其激活能力只为Mg2+的39%。Robertson等在研究大肠埃希菌表达的ICL时也证明Mn2+可以替代部分Mg2+对异柠檬酸裂解酶活性的激活作用17，而其他二价阳离子如Co2+、Fe2+、Ca2+、Ba2+、Ni2+、Cd2+、Zn2+、Cu2+和Hg2+则不能明显的激活酶的活性。Glachetti等证明异柠檬酸裂解酶的真正底物不是异柠檬酸，而是Mg2+异柠檬酸复合物18，以此说明为何Mg2+对ICL具有激活作用。    学者

17、混合两种等量的二价金属离子，以测定其对异柠檬酸裂解酶的抑制性。发现Ca2+和Ba2+的混合试剂无法抑制ICL的酶活性；Mn2+与Zn2+混合可以抑制将近25%的酶活；其他阳离子的抑制率无法达到更高的水平。    ICL的酶活性有pH依赖性。在pH为6.87.0的酶反应体系中，异柠檬酸裂解酶的活性最高。pH低于6或高于8时酶活性仅为最大酶活的一半；而当pH高于9，酶活性则完全丧失。    3.5  结核分枝杆菌中的另一种异柠檬酸裂解酶    通过对结核分支杆菌(H37Rv)基因组的序列分析人们发现

18、了第二种编码异柠檬酸裂解酶的基因aceA。推测aceA是由于移码突变而形成的开放阅读框(ORF)，其被认为是一个假基因(pseudogene)。这个基因表达的蛋白由766个氨基酸组成，蛋白的分子量约为84.3ku。    尽管都可以表达异柠檬酸裂解酶，但这两个基因(icl和aceA)的作用并不相当，有证据表明aceA不能补充icl的缺失8。生化方面的研究显示AceA的异柠檬酸裂解酶活性明显低于ICL的酶活，AceA只是对ICL的辅助，并不能在乙醛酸支路中发挥作用。但由于AceA与ICL有一些共同的活性区域(如KKCGH)14，如果找到对这两个蛋白均有抑制作用的抑制剂，其作用位点则更