猪长骨脱细胞骨细胞外基质的制备及生物力学、组织学性质的初步检

1、    猪长骨脱细胞骨细胞外基质的制备及生物力学、组织学性质的初步检测        摘要：目的寻找适合骨移植的骨组织替代物骨脱细胞细胞外基质（ABECM）。方法将猪股骨用组织工程学的方法进行适当的脱细胞处理，制成ABECM，再进行HE染色和扫描电镜、透射电镜观察，及纵向压缩的生物力学性质的检测。结果ABECM未见细胞成分，细胞外基质基本结构未被破坏；ABECM在生物力学性质上与新鲜股骨无明显差异。结论ABECM是一种新型的理想的骨替代物，有广泛的应用前景。关键词：骨；骨替代

2、物；组织工程；脱细胞细胞外基质；生物力学性质中分类号：R318.08文献标识码：A文章编号：1004-6526(2000)06-0331-04Preparation of porcine long bone acellular bone extracellular matrix（ABECM）and preliminary measurement of its biomechanical and histological qualitySHA Di,JIANG Yin-ling,GAO Jing-heng,et al.(Anatomy Department,China Medical Unive

3、rsity,Shenyang 110001,China)Abstract:ObjectiveTo find a new kind of bone substitute-acellular bone extracellular matrix (ABECM) available for bone implant.MethodsPorcine femur was approached acellularly by using tissue engineering ways,ABECM was thus prepared.Then measurement of biomechanical and hi

4、stological quality were brought out.ResultsThere were no cellular components in histological slides;The basic structure of extracellular matrix existed.There was no statistic difference between ABECM group and control group.ConclusionABECM is a new kind of ideal bone substitute and could be applied

5、widely in the future.Key words:Bone;Bone substitute;Tissue engineering;Acellular extracellular matrix;Biomechanical quality骨骼由于各种原因造成缺损后的修复是骨外科、颌面外科、整形外科及修复重建外科的主要研究内容。目前常采用移植各种替代物来修复骨缺损。骨替代物的种类很多。关于它们的研究均取得了一定的进展，但仍存在着一些问题。第一自体骨移植的供区损伤及异体骨、异种骨的抗原性问题；第二人工合成替代物引起的异物反应、继发感染及致癌性问题；第三各种替代物不能实现完全的功能替代，特别

6、是负重部位缺损的替代。这就迫使科学家寻求更为理想的骨替代物。近20年来，由于组织类型培养技术的普及，细胞生物学、分子生物学、生物化学等学科的发展和生物医学材料的开发及利用，产生了一门新的学科组织工程学（Tissue Engineering），骨组织工程学是其中的一部分。1995年Geneview系统提出了骨组织工程学的概念，其研究内容之一便是骨细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）替代物，即骨替代物的开发14。由于骨骼的特殊功能，对骨组织替代物的性质提出了较高的要求，特别是负重部位骨的替代物。除了要具有良好的生物相容性、生物可降解性、良好的骨诱导性和骨传导性外，还要具有

7、一定的承受负荷的能力，以防止移植后疲劳失败（Fatigue Failure）的出现。近年来有关脱细胞的细胞外基质的文献报道58，为研究新型骨替代物提供了思路。本实验用组织工程学的方法，对长骨进行适当的脱细胞处理，以期得到在生物相容性、骨诱导性和生物力学性质上更接近与正常骨组织的骨替代材料，并为其能够尽快用于临床治疗和市场化提供依据。1材料和方法1.1新鲜猪股骨（购于沈阳市肉联厂）；脱细胞的各种试剂（由华美生物工程公司提供）；其它试剂和药品购于沈阳市药材公司。1.2猪长骨标本的准备取新鲜猪股骨中1/3段，去除骨膜、骨髓部分，蒸馏水冲洗3次，置于PBS保存液中（0.1mol,pH 7.4,青霉素1

8、00U/ml）,用于制备骨ABECM。1.3骨ABECM的制备在适宜的温度、pH值条件下，采用低渗-去垢剂方法对骨进行组织工程学的脱细胞处理,按照处理时间长短分为ABECM 1组和ABECM 2组（ABECM 1的各部骤处理时间较ABECM 2减少一半），以新鲜猪股骨为对照组。1.4骨新鲜标本和ABECM 2组标本生物力学性质的检测（由中国科学院金属研究所材料疲劳与断裂国家重点实验室完成）：取对照组和ABECM 2组标本各10个，检测前测量标本的高度、平均外直径、平均皮质厚度，经t检验以上指标实验组和对照组无显著性差异（表1）,以防止由于标本本身特点引起的实验误差。由德国申克公司出品100KN

9、电液伺服服务机进行标本纵向压缩实验。 1.5组织学性质的检测骨新鲜标本、处理时间上有区别的两组ABECM标本10%中性甲醛固定，分别经5%稀硝酸脱钙处理两周后，常规石蜡包埋，制成5m切片后进行以下染色及光镜观察：HE染色；四环素趋骨性荧光标记，IG激发荧光，OLYMPUS BX60显微镜下观察。1.6扫描电镜和透射电镜观察。1.7统计学方法采用SPSS统计软件包进行数据处理，数值以?Ax-U?±s表示，采用t检验计算P值，P0.01为差异非常显著。2结果2.1新鲜股骨标本与ABECM肉眼对比观察处理后得到的ABECM在外观上无明显变化，只是颜色较新鲜标本略白。2.2生物力学性质检测对

10、照组和ABECM 2组压缩试验结果见表2。表中显示经过脱细胞处理后，长骨的压缩破坏负荷、破坏极限、压缩极限、极限比率等几项指标均有减少和降低，但是无统计学意义，其纵向压缩的力学性质没有明显的改变。2.3组织学检测结果2.3.1HE染色新鲜的猪股骨组织切片中可见骨陷窝中含有大量细胞结构，胶原纤维排列整齐；ABECM 1组骨陷窝、骨小管中尚有嗜酸性物质残留；ABECM 2组标本可见细胞成分基本消失，骨陷窝、骨小管空虚，胶原纤维排列整齐。2.3.2四环素趋骨性荧光标记对照组见荧光分布于骨陷窝，ABECM 1组织切片在暗视野下可见骨组织的残留成分，但未见荧光;而ABECM 2组则未见荧光。2.4SEM

11、和TEM观察透射电镜观察ABECM胶原纤维排列整齐， ABECM 1骨陷窝中尚可见细胞结构，有的细胞膜已被破坏；处理时间长的ABECM 2骨陷窝基本空虚(12)。扫描电镜观察可见胶原纤维排列整齐，其上有颗粒附着；处理时间短的ABECM骨陷窝中可见少量细胞成分，而处理时间长的ABECM骨陷窝基本空虚(34)。3讨论3.1关于骨ECM成分及在骨再建过程中的作用骨细胞外基质,又称骨基质(bone matrix),是骨组织钙化的细胞间质,由有机和无机成分组成。有机成分包括胶原纤维和一些无定形物质，均由骨细胞分泌而产生。胶原纤维占有机成分的95%，主要由I型胶原蛋白构成，还有少量的V型胶原蛋白。无定形物

12、质的含量只占5%，呈凝胶状，化学成分为硫酸软骨素、硫酸角质素、和透明质酸。蛋白质成分中有些具有特殊作用，如骨粘连蛋白和骨钙蛋白。骨细胞外基质的无机成分主要为钙盐，多以羟基磷灰石结晶的形式存在910。骨细胞外基质在骨再建中发挥以下作用：纤维粘连蛋白、层粘连蛋白具有有丝分裂原的活性：纤维粘连蛋白能够在细胞周期的G1早期发挥作用，使在有血清的情况下生长已经停止的纤维母细胞重新合成DNA。另有研究表明纤维粘连蛋白在正常组织中并不表现有丝分裂原的作用，当创伤等条件下纤维粘连蛋白降解，分离出活性片段促进愈合。此片段还能促进培养细胞的转化，而表现促分裂的作用。层粘连蛋白也能促进上皮细胞增殖的作用。有学者认为

13、，上述两种蛋白在发育过程中刺激和引导细胞运动是其主要作用。细胞外基质是生长因子的储存部位：骨组织中含有多种生长因子，如胰岛素样生长因子（IGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子-（TGF-）、肿瘤坏死因子（TNF）、骨形态发生蛋白（BMP）等。IGF、PDGF、FGF是成骨样细胞和骨细胞的促分裂因子，对多种来源的骨内细胞的DNA合成和增殖有很强的促进作用。TGF-对成骨细胞的增殖是一种多功能的调节因子，有浓度和细胞密度依赖性，并在协调骨组织局部生长因子的作用中起重要的作用。BMP是一类有骨诱导活性的酸性蛋白，诱导未分化的间质细胞不可逆的分化为软骨和骨

14、，对促进骨缺损的修复具有显著作用11。基于生长因子在骨再生中的重要作用，有学者提出骨替代材料应是种子细胞、合适的支架材料和生长因子的复合。骨细胞外基质在骨再建过程中的作用就要求我们在制作骨ABECM时，应尽量保留促进成骨的各种成分，去除细胞的同时，减少对细胞外基质的损伤，使骨ABECM具有最大程度的成骨活性。从HE染色切片可见我们制作的ABECM无细胞成分，胶原纤维排列有序，压缩实验证实ABECM的力学性质较正常骨无明显变化，故大体上满足了作为骨替代物的基本要求。表1对照组和实验组标本高度、外直径、皮质厚度的比较高度(mm)外直径(mm)皮质厚度(mm)对照组57.63±8.2721

15、.22±2.0574.294±1.238ABECM 2组60.99±13.63221.35±2.0494.119±0.400标本数101010P值0.010.010.01表2猪股骨脱细胞前后生物力学性质的比较压缩破坏负荷（KN）强度极限(Kgf/mm2)压缩极限(mm)极限比率(%)对照组11.439±2.5925.539±1.1882.289±1.0313.839±1.390ABECM 2组11.165±2.7895.085±1.1651.809±0.7702.862

16、77;0.655标本数10101010P值0.010.010.010.011骨陷窝中残留结构，细胞膜已破(ABECM 1组，透射电镜×25K)2骨陷窝和骨小管(ABECM 2组，透射电镜×10K)3骨陷窝中的残留结构(ABECM 1组，扫描电镜×1?000)4空虚的骨陷窝(ABECM 2组，扫描电镜×3?500)3.2关于骨ABECM(NECM)的制备过程由于骨组织缺损给患者带来巨大的生理和心理上的损伤，有关方面的学者不断探索良好的骨替代物，特别是生物机体来源的替代物。1965年Urist研制成功了脱钙骨基质（DBM），植入肌肉后诱导异位成骨。后来从DB

17、M中提取出了成骨活性更高的骨基质明胶（BMG），BMG中含有BMP等有效成分，可以诱导未分化的间充质细胞转化为成骨细胞12。国内有报道，BMG与其它化学成分如丹参等复合修复颅骨缺损13。Yamashita证实BMG诱导成骨的钙沉积过程是无细胞的物质沉积（acellular mineral deposition）,而骨生成在此过程之后。1415DBM及BMG虽然有成骨活性，但两者只保留了细胞外基质中的有机成分，在力学性质上难以达到修复负重部位缺损的要求。天然型无机骨（NNB）是经理化处理后，去除有机成分的具有网状孔隙骨组织替代材料。NNB的一个显著特点是良好的力学性质，修复区的力学性质检测可达正

18、常骨的90%以上，可以用来修复负重部位的缺损，但NNB无诱导成骨的活性，不能实现大量诱导成骨表达的目的。上述材料在骨修复过程中无疑都是良好的替代物，但由于只保留了骨基质中有机或无机成分，应用过程中难以两全其美。我们总结以上的经验，设计了只脱细胞，而无机成分和有机成分均予以保留的方案。制作出的ABECM具有良好的组织相容性、骨诱导性和力学性质，是一种理想的骨组织替代材料。在脱钙的问题上，我们认为可以根据实际情况而定，如果是用于颅面部骨缺损修补可以适当脱钙，而四肢特别是下肢骨缺损则无须脱钙，材料经环氧乙烷消毒后即可以使用。3.3关于骨ABECM在组织工程中及临床的应用前景3.3.1由于ABECM的

19、组织学和力学特点使其在骨组织工程领域有广泛的应用：是体外细胞培养的理想支架：支架材料的表面特征、孔隙的多少、孔径等是影响种子细胞粘附、增殖的重要因素。ABECM保留了骨细胞外基质的生理结构,为种子细胞的种植提供了良好的三维空间结构和生长环境。种子细胞可以进入脱细胞后留下的骨陷窝空穴，与ABECM成分相互作用，产生新骨。是复合材料的良好支架：随着组织工程学的深入研究，广大学者认识到单纯依靠种子细胞和支架材料诱导成骨难以达到大量成骨的要求，故提出了构建种子细胞、支架材料和生长因子复合的理想的组织替代物的想法。BMP具有高度的骨诱导活性，日益受到重视。BMP与未分化的间充质细胞细胞膜上特异的膜受体结

20、合，通过膜电位的改变激活细胞内调节因子及其相关基因，最终引起细胞分化为成骨样或成软骨样细胞，产生新骨。研究表明BMP与骨基质同时植入，明显提高BMP的诱导骨形成能力。10ABECM含有骨基质的主要成分，有望与BMP复合应用，如果再加入适宜的BMP靶细胞，无疑将增加骨的形成量。而且这种复合为进一步探讨三者之间的相互作用和作用机制提供了依据。可应用于临床各种类型的骨组织缺损：ABECM制作简便，可以建立一个ABECM库，根据患者缺损的部位、骨的运动功能类型的要求制作不同形状、大小、硬度的ABECM。可以直接植入或按组织工程的方法，将患者的骨髓或骨膜来源的成骨细胞在体外扩增细胞到一定程度后，再进行手

21、术植入，以提高移植效果。3.3.2需解决的问题制作过程的优化，使之更适合种子细胞的附着和增殖，并通过异种和异体动物实验进一步证实ABECM的免疫学性质；与其它基础学科联合进一步研究ABECM的受体性质，细胞增殖产生的细胞外基质与ABECM所含基质间的关系，ABECM的降解和吸收特征等；与临床各相关科室共同研究ABECM的最佳植入时间、植入状态及术后处理方式（如固定方式和患者可以活动时间）。4结论ABECM具有良好的生物相容性、骨诱导性和生物力学性质，并可以和种子细胞、生长因子复合，是一种理想的骨组织工程支架材料和骨组织替代物。作者简介：沙镝(1974-)，女，辽宁铁岭人，医学硕士作者单位：沙镝

22、(中国医科大学解剖教研室，辽宁沈阳110000)姜英令(中国医科大学附属一院烧伤科，辽宁沈阳110001)高景恒(辽宁省人民医院整形外科，辽宁沈阳110015)吕永利(中国医科大学解剖教研室，辽宁沈阳110000)参考文献：1张晨,高景恒.组织工程的提出及其研究现状J.实用美容整形外科杂志,1996,7(1):46.2Crane GM,Ishaug SL,Mikos AG.Bone tissue engineeningJ.Nature Medicine,1995,1(12):1322.3沙镝，英彬，吕永利,等.骨组织工程的进展J.实用美容整形外科杂志,1999,10(2):102.4Mizun

23、o H,Takeda A,Uchinuma E.Promising therapy for congital giant pigmented nevi using acellular autograft nevi-dermal matrixJ.Ann Plast Surg,1999,43(3):273.5姜笃银,陈璧,贾赤宇,等.戊二醛交联的异种/异体脱细胞真皮基质的制作及临床应用观察J.第四军医大学学报,1999,20(5):371.6Dahms SE,Piechota HJ,Dahiya R,et al.Composition and biomechanical properties of the bladder acellular matrix graft:comparative analysis in rat,pig and humanJ.Br J Urol,1998,82(3)