自己总结：流式细胞仪的原理和用途

1、流式细胞仪(Flow Cytometry1 流式细胞仪的概念及其发展历史1. 1 流式细胞仪的基本概念 流式细胞仪(flow cytonletry , FCM 是对高速直线流动的细胞或生物微粒 进行快速定量测定和分析的仪器,主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术,计算机对数据的采 集和分析技术等。 流式细胞仪以流式细胞术为理论基础,是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫 学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。 流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞 的技术。其特点是:测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量,即对同一个细胞做有关物理、生物化 学特性的多参数测量,且在统

2、计学上有效。1. 2 流式细胞仪的发展简史 最早的流式细胞仪雏形诞生于 1934年, Moldavan 提出使悬浮的单个血红细 胞 流 过 玻 璃 毛 细 管 , 在 亮 视 野 下 用 显 微 镜 进 行 计 数 , 并 用 光 电 记 录 装 置 测 量 的 设 想 。 1953年 Crosland-Taylor 根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。 其后又经过 Coulter 、 Parker & Horst 、 Kamentsky 、 Gohde 、 Fulwyler 、 Herzenberg 等人的不断改进,设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成 了计算机与流式细胞仪

3、的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、 推广流式细胞仪在临床上的应用。 近 20年来,随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善, 人们越来越致力 于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作,以扩大 FCM 的应用领域和使用效果。宋平根的流式细胞术的原理和应用是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著 作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等,例举了其在医学和生物工程 中的应用, 非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是 13年前出版的, 所以基本上没有涉及植物流 式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识

4、的人士来说,这本书太复杂太深奥。谢小 梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理,简单提及了流式细胞 仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后,用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术 必须了解的一些原理,并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。2 流式细胞仪的工作原理和技术指标2. 1 流式细胞仪工作原理 除电源外,流式细胞仪主要由四部分组成:流动室和液流系统:激光源和光学 系统;光电管和检测系统;计算机和分析系统,其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信 号的产生、转换和传输的任务。流动室和液流系统流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成,

5、常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和 制作均很精细, 是液流系统的心脏。 样品管贮放样品, 单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出; 鞘液由鞘液管从四周流向喷孔,包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液,一般限制液流 速度 <10m/s。由于鞘液的作用,被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体,受到 振荡信号可发生振动。激光源和光学系统经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。 常用的光源有弧光灯 和激光; 激光器又以氩离子激光器为普遍 ,也有配和 氪离子激光器 或染料激光器。 光源的选择主要根 据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最

6、常用的弧光灯 ,其发射光谱大部分集中于 300400nm ,很 适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中,绿光 514nm 和蓝光 488nm 的谱线最强, 约占总光强的 80%;氪离子激光器光谱多集中在 可见光 部分,以 647nm 较强。免疫学上使用的一些荧 光染料激发光 波长 在 550nm 以上,可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份,可使 原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有 Rhodamine6G 水溶液的染料激光器 , 则可得到 550650nm 连续可调的激光,尤在 590nm 处转换效率最 高,约可占到一

7、半。 为使细胞得到均匀照射,并提高分辨率,照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞 直径相近。 因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径 d 可由下式确定:d=4f/D 。 为激光波长; f 为透镜焦距; D 为激光束直径。色散棱镜用来选择激光的波长,调整反射镜的角度使调谐到所需要 的波长 。为了进一步使检测的发射荧光更强,并提高荧光讯号的信噪比,在光路中还使用了多种滤 片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用 525nm 带通滤片只允 许 FITC (Fluoresceinisothiocyanate, 异硫氰荧光素发射的 525nm 绿光通过。长波通过二向色性 反射镜只

8、允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。 在免疫分析中常 要同时探测两种以上的波长的荧光信号,就采用二向色性反射镜,或二向色性分光器,来有效地将各 种荧光分开。光电管和检测系统经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量 的。 光电倍增管(PMT 最为常用。 PMT 的响应时间短,仅为 ns 数量级;光谱响应特性好,在 200 900nm 的光谱区,光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从 10到 10可连续调节 ,因此对弱光测量十分有利。 光电管运行时特别要注意稳定性问题, 工作电压要十分稳定, 工作电流及功率不能太大。 一般功耗

9、低于 0.5W ;最大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理,并注意良好 的磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不同的 PMT ,因为光谱响应特性不同,不宜互换。也有用硅光 电二极管的,它在强光下稳定性比 PMT 好。从 PMT 输出的电信号仍然较弱,需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类 放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系,称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范 围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号,例 DNA 测量等。另一类是对数放大器,输出信号和 输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。因为在免疫分析时常要同时显示 阴性

10、、阳性和强阳性三个亚群,它们的荧光强度相差 12个数量级;而且在多色 免疫荧光 测量中, 用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节 便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响 等优点。计算机和分析系统经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的,也是和光 信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号 再经 模 -数转换器 输往微机处理器编成数据文件,或存贮于计算机的硬盘和软盘上,或存于仪器内以 备调用。计算机的存贮容量较大,可存贮同一细胞的 68个参数。存贮于计算机内的数据可以在实 测后脱机重现,进行数据处理和分析,

11、最后给出结果。除上述四个主要部分外,还备有电源及压缩气 体等附加装置。2. 1. 1 信号的产生、转换和传输 在压力作用下,鞘液管中的鞘液被持续不断地压入流动室,形成一股 稳定地连续的液流, 保证了样本液稳定地处于鞘液液流的轴线上, 并以单个细胞形式直线通过激光照射区。 激光照射区又称测量区,是指液流与激光束垂直相交的点。当细胞携带荧光素标记物 (每种物质携带的标 记物不同吗 ? 通过激光照射区时,产生代表细胞内部不同物质、不同波长的荧光信号,这些信号以细胞为 中心,向空间 360°立体角发射 ,产生散射光和荧光信号。 散射光不依赖任何细胞样品的制备技术,因此 被称为细胞的物理参数或

12、固有参数。散射光又包括前向角散射和测向角散射。 前向角散射与被测细胞直径 的平方密切相关,测向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感,可提供有关细胞内精细结构和颗 粒性质的信息。荧光信号也有二种;一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号,另一种是经过特 异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。在免疫分析中常要同时探测两种以上波长的荧光信号,就采用二向色性反射镜,或二向色性分光器,来有效地将各种荧光分开。经荧光染色的细胞受到适合的光激发后产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。最常用 的光电转换器是光电倍增管(PMT 。从 PMT 输出的电信号需要经过放大后才能输入分

13、析仪器。流式细胞仪 中一般备有两类放大器。一类是线性放大器,其输出信号与输入信号成线性关系。线性放大器适用于在较 小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号,如 DNA 测量等。另一类是对数放大器,其输出信号 和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。放大后的电信号被传送到计算机, 再经模一数转换器传输到微机处理器形成数据文件,保存在计算机上。保存在计算机上的数据可在脱机后 再进行数据处理和分析。参数(例如:细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构测量原理流式细胞仪可同时进行多参数测量,信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在 测量区进行的,所谓测量区就是照射激

14、光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通 过测量区时,受到激光照射会向立体角为 2(360°的整个空间散射光线, 散射光的波长和入射 光的波长相同。 散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关,因 为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。 未遭受任何损坏的细胞对光线都具 有特征性的散射,因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。 经过固定的和染 色处理的细胞由于光学性质的改变,其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的 细胞的参数相关,还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。在 流式

15、细胞术 测量中,常用的是两种散射方向的散射光测量:前向角(即 0角散射(FSC ; 侧向散射(SSC ,又称 90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光 电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来, 前向角散射光的强度与细胞的大小有关 ,对同种 细胞群体随着细胞截面积的增大而增大; 对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积 大小成线性关系;对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大,尤其需要注意。 侧向散射光的测 量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。 侧向散射光虽然也与细胞的形状和大 小有关,但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感,也

16、能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。 在实际使用中,仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时,可鉴 别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。 荧光信号主要包括两部分:自发荧光,即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出 的荧光;特征荧光,即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光,其荧光强度较弱,波长也与照射激光不同。 自发荧光信号为噪声信号 , 在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。 在 免疫细胞化学 等测量中, 对于结合水平不高的荧光抗体来说, 如何提高信噪比是个关键。 一般说来, 细胞成分中能够产生

17、的自发荧光的分子(例核黄素、细胞色素等的含量越高,自发荧光越强;培养 细胞中死细胞 /活细胞比例越高,自发荧光越强;细胞样品中所含亮细胞的比例越高,自发荧光越强。 减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是:尽量选用较亮的荧光染料;选用适宜的激光 和滤片光学系统;采用电子补偿电路,将自发荧光的本底贡献予以补偿。2. 1. 2 流式细胞仪分选原理 并不是所有的流式细胞仪都具有分选功能。流式细胞仪的分选功能是由细 胞分选器来完成的。由喷嘴射出的液流柱在电信号作用下发生振动,断裂形成均匀的小液滴。根据选定的 某个参数由逻辑电路判明是否将被分选,而后由充电电路对选定细胞液滴充电,带电液滴携带细胞通过静

18、电场而发生偏转,落入收集器中。使用不同孔径的喷孔及改变液流速度,可能会改变分选效果。从参数测 定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键,可根据具体要 求进行适当调整。2. 1. 3 数据的显示和分析 数据处理主要包括数据的显示和分析。单参数直方图是使用最多的图形显示 形式,既可用于定性分析,又可用于定量分析。单参数直方图是由 X 、 Y 二方向组成的二维平面图。横座标 X 是所测的荧光或散射光的强度,用“道数” (Channel No. 来表示。选择的放大器类型不同,标度不同。 纵座标 Y 通常表示被测细胞的绝对数目。正常情况下,数据分析得到的图形为具有一

19、个或若干个峰的曲线 图。对曲线图的解释应该具体问题具体分析。除直方图外,数据显示方式还包括二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。二维点图也是比较常 用的数据显示类型。它显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系,也是二维平面图,横纵坐标可以根据 自己选定的被测参数自行决定,点的位置表明了细胞和颗粒具有的二个被测参数的数值。二维点图所提供 的信息量要大于单参数直方图。数据分析的方法大体可分为参数法和非参数法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型时则多 使用参数方法。非参数分析法不用对显示的图像做任何假设,也不采用数学模型,分析程序可以很简单, 也可能很复杂。临床医学较常使用非参数分析法

20、。2. 2 流式细胞仪性能的技术指标 流式细胞仪性能的技术指标主要有荧光分辨率、 荧光灵敏度、适用样品 浓度、分选纯度等。荧光分辨率是指分辨两个相邻峰的最小距离,通常用变异系数(CV 值来表示。现在 市场上主流型号出厂时的荧光分辨率应该小于 2.0%。荧光灵敏度反映了仪器探测最小荧光光强的能力。一 般用荧光微球上可测出的 FITC 的最少分子数来表示。目前仪器均可达到 1000左右。仪器工作时样品浓度 一般在 105107细胞 /ml。 分析速度 /分选速度是指流式细胞仪每秒种可分析或分选的颗粒数目。 一般分析 速度为 500010000,分选速度控制在 1000以下。流式细胞仪测量的数据是相

21、对值,因此需要在使用前对系统进行校准或标定。流式细胞仪的校准有二个目 的,即仪器的准直调整和定量标度。通常使用标准微球作为非生物学标准样品,鸡血红细胞做为生物学标 准样品。3 主流流式细胞仪型号及其特性介绍目前拥有市场较大份额的公司是美国的 BD (Becton-Dickinson 公司、 Beckman-Coulter 公司(原名称 Coulter 和德国的 Partec 公司。3. 1 BD公司流式细胞仪介绍 BD 公司生产的流式细胞仪都冠以 FACs (fluorescence activated cell sorter ,即荧光激活细胞分选器。其型号种类比较齐全,如早期的 FACSor

22、t 、 FACS Canto、 FACSean 。现 在市场上供应的型号有五种:FACSCount (小型流式细胞仪 、 FACS CAlibur (流式细胞仪 、 FACSA ria (流 式细胞分选仪 、 FACSV antage SETM(多色分析和高速分选流式细胞仪 、 LSR II (数字化分析型流式细胞 仪 。FACSCount 为精确计数淋巴细胞 CD3, CD4, CD8绝对数而设计的。 FACSCalibur 是全自动多色流式系统,偏 重于临床,其整体设计帮助临床医生快速实现常规免疫表型、 CD4T 细胞计数、 DNA 、网织红细胞、血小板 等临床分析,兼具分选功能。配备有二

23、根激光管,可同时检测 4个荧光参数。可识别粘联细胞。BD FACSA ria 流式细胞分选仪为台式高速细胞分选仪, 获取速度达 70, 000细胞 /s, 分析速度达 50, 000/s。 使用石英杯流动检测池固定光路校准技术。使用三种激光,多色分析,分析参数可达 15色。两管或四管分 选,可以使用多种规格的收集管。液流监测系统白动监测液流断点,检查堵塞,实现了细胞分选的无人操 作。配件 BDACDU 装置,可以在微孔板或载波片上定量分选细胞。FACSV antage SETM是在 FACSV antage的细胞分选功能基础上推出的分选增强型流式细胞仪。六色荧光分 析系统,点对点分选,配置 F

24、ACS Diva 数字化系统,提供全面的配套试剂。速度和功能优于 FACSV antage 。 BD LSR II是 LSR 的数字化升级版,其性能介于 FACSV antage SE和 FACS Calibur之间,是专为生命科学 研究设计的台式机。配备固定校准的紫外激光,四种激光立体空间激发、十色荧光同时分析、电子系统数 字化、比较易学易用。3. 2 Beckman-Coulter 公司流式细胞仪介绍 Beckman- Coulter 公司生产的流式细胞仪以 Profile (早期, 现已停产和 EPICS 系列为代表,近年又推出了 Cytomics FC500系列。 EPICS 系列是大

25、型流式细胞仪,目 前市场上有 XL 、 XL-MCL 和 ALTRA 三种型号,其中 ALTRA 具有分选功能,适用于免疫学、细胞生理、分子生 物学、遗传学、微生物学、水质分析和植物细胞分析。 Cytomics FC500系列流式细胞仪体积小,可自动进 行 5种颜色的分析, 适用于免疫学检测, 如人类 HIV 诊断。 特别是 FC500MPL 的独特设计可以在同一系统上 使用 12×75mm 的离心管和 24或 96孔的平板。特别适合工作量大的实验室。这二个公司主要针对医学研究和临床工作进行设计和生产,其产品可应用于生物医学基础研究以及临床检测的许多领域,如遗传、肿瘤、血液、免疫等诸

26、多研究中红细胞、 T 细胞、淋巴细胞亚群测定、检测早期 细胞凋亡、肿瘤细胞免疫测定等。这二个公司的流式细胞仪价格昂贵,我国主要购买、使用的单位基本上 都是一些医疗机构。3. 3 Partec公司流式细胞仪介绍 与 BD 和 Becman-Coutler 公司的产品相比,德国 Partec 公司生产的流 式细胞仪的共同特点是体积小,造价低,易操作,便于携带,适合植物学研究,适合边远地区和发展中国 家。 德国 Partec 公司的产品分为三类:CCA 家族、 PAS 家族和 CyFlow 家族 (Galaxy 为早期产品,已停产 。 CCA 家族包括细胞计数分析仪 CCA 和倍性分析仪 PA-I

27、。它是单或双参数的台式小型机,可以进行一些常规 分析, 如核 DNA 测定 (检测倍性或细胞周期 、 细胞计数、 细胞凋亡。它的特点是体积小, 易操作, 价格低, 检测范围广,可以检测多种荧光素(如 PI 、 DAPI 、 Fluorescein 发出的荧光。 PAS 家族包括粒子分析系统 PAS 、粒子分析系统 III (PAS-III 和倍性分析仪 PA-II 。提供三种激光器的三种组合,可检测十余种荧光 染料。 最多可检测和记录八个独立荧光参数。 倍性分析仪 PA 能够在 2分钟内自动测量植物的倍性水平, 检 测异倍体。可以对叶片、幼苗、种子、果皮、根、花等植物材料进行分析。在大多数植物

28、中,异倍体染色 体的检测分辨率为±1条染色体。 PA-I 使用 HBO-100汞灯,属于弧光灯,可产生紫外激发光和蓝光。 PA-II 中增加了 488nm 氩离子激光器,能够检测几乎所有的荧光染料,如 DAPI , Hoeehst , PI , EB , MMC , FITC , FDA 等。汞灯发光是电流经过气体时,气体电离产生的。它能提供最佳的激发波长。CyFlow (R SL 配备三种激光管,可应用于诸如人类健康、微生物学、工业应用、过程控制、生态学等研 究。如 HIV 扫描中免疫标记细胞计数、食品处理过程中的微生物计数、细胞凋亡等。它使用 l2 V直流电, 特别适合边远地区和

29、发展中国家。国际上 20世纪 80年代开始将流式细胞仪检测应用到植物的研究中(Galbraith , 1983 ,众多学者都认为 流式细胞仪是一种准确、快速的检测 DNA 含量的方法(Michaelson , 1991 。应用范围主要是利用流式细胞 仪研究属内、属间多种植物的 DNA 含量(Baird , 1994; Jacob , 1996; HALL , 2000和倍性水平(Costich , 1993; Meng , 2002 、检测体细胞杂种(Pfosser , 1995; Keller , 1996和游离小孢子培养再生株(Kim , 2003的 DNA 含量。过去我国应用这一检测技术

30、的植物研究工作者寥寥无几,且大多是在国外实验室完成 的。研究内容包括植物生理、程序性死亡、倍性鉴定等。植物研究中使用的流式细胞仪基本上都是 Partec 公司的产品, 也有少量是 BD 公司生产的流式细胞仪。 BD 公司的产品主要定位于医学研究与应用, 与 Partec 产品相比, 不太适合从事植物染色体倍性的鉴定。 主要体现在不能提供植物样品制备技术 /试剂, 数据获取 软件可同时检测到的倍性数目少。 鉴于目前我国科研院所中使用较多的是 BD 公司生产的流式细胞仪, 在下 一篇中将会对利用 BD 流式细胞仪进行植物倍性检测的技术和技巧做详细报告。如何选择流式细胞仪自七十年代出现第一代流式细胞

31、仪以来,随着计算机技术、电子制造技术、激光技术及荧光素合成技术的 不断发展,现代流式细胞仪已今非昔比,制造工艺、功能、精确度有了质的飞跃。流式细胞仪生产厂商推出各种不同型号的流式细胞仪来满足用户的不同需要。现生产流式细胞的厂商全球 至少有六家,各厂商产品又有不同的系列,各具特点。如何从众多的型号中挑选出最适合自己的机型,我 们还需从分析应用出发,评估自己的需求来决定什么样的流式细胞仪最具性价比、最适合自己。、 DNA 倍体分析DNA 分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目。由于恶性细胞 DNA 含量通常与正常细胞不同,存 在异倍体细胞,所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关

32、系。 DNA 含量检测还可提供细 胞周期方面的信息,这在细胞生物学中运用很广泛。特别地,它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。 这些 DNA 检测还可与细胞表面标志物标记同时进行,这样在细胞混合培养中,可通常追踪表达特异标志物 的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光,常用的染 料为 PI , DAPI 。流式细胞仪要求:488nm 光源, 575nm 滤光片。、细胞生存能力实验使用 Heochest 33342染料与 DNA 特异性结合,后因细胞活力不同,染料的结合程度也各异,故可评估细胞 的活性度。流式细胞仪要求:360nm 光源, 455nm 滤

33、光片。、计数外周血中检测网织红细胞使用 TO 染料能够特异性地与 RNA 结合,结合系数高达 3000,故具有很好的性价比。流式细胞仪要求:488nm 光源, 525nm 滤光片,液量绝对计数系统。、外周血、骨髓采集物中 CD34阳性干细胞计数,临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定使用标准 ISHAG 方案, 需要 DNA 或其他核染料占用 FITC 通道, PE 标记 CD34抗体, PE-CY5标记 CD45抗体。 流式细胞仪要求:488nm 光源, 525nm 、 575nm 、 675nm 滤光片,液量绝对计数系统。、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之

34、间是否存在反应有着重要临床意义,因为这种反应会导致 移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。 FITC 标记人免疫球蛋白抗体、 PE 标记粒细胞表面标志物、 PE-CY5标记 HLA 抗体。 流式细胞仪要求:488nm 光源, 525nm 、 575nm 、 675nm 滤光片。、血小板自身抗体检测血小板自身抗体识别人血小板抗原,会引起各种临床相关症状,如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫 癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。 FITC 标记抗人免疫球蛋白抗体、 PE 标记识别血小板抗体。流式细胞仪

35、要求:488nm 光源, 525nm 、 575nm 滤光片。、移植交叉配型原细胞毒实验,主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测 T 或 B 细胞是否受到受体血清 中免疫球蛋白攻击,作为 HLA 配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。 FITC 标记抗人免疫球蛋白抗体、 PE 标记识别 T 细胞 CD3或 B 细胞 CD29抗体。仪器要求:488nm 光源, 525nm 、 575nm 滤光片。、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应淋巴细胞早期活化指标 CD69可用来检测免疫治疗效果。 流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化 情况:FITC 标

36、记的 CD3抗体、 PE 标记的 CD8抗体、 PE-CY5标记的 CD69抗体。流式细胞仪要求:488nm 光源, 525nm 、 575nm 、 575nm 滤光片。、检测细胞内因子(TH1/TH2细胞检测未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少,用流式细胞仪很难检测出来,因此在检测前需刺激活化。活化 所用的刺激素为 PMA 佛波酯 +Ionomycin。淋巴细胞在刺激素的作用下,活化分泌细胞因子到细胞外。因流 式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测,如细胞因子分泌到细胞外则检测不到,因此必须阻止细 胞因子的分泌。抑制细胞因子分泌的试剂为 Brefedlin A或 Monensin 。 T

37、h1/Th2细胞首先是 CD4+T细胞, 因此存在着用 CD4来设定细胞群的问题。 我们知道 CD4不但在 T 细胞上表达, 还在所有的单核细胞上表达, 因此单独用 CD4设门无法将 CD4+T细胞区分开来。那么我们用 CD3和 CD4双参数设门是否可以呢?回答是 否定的。因为在佛波酯的刺激作用下 CD4 抗原的表达会迅速下调,甚至完全丧失,所以不适合于设门。用 CD3和 CD8设门,因 CD8不受佛波脂的影响且绝大多数 CD3+CD8-的细胞都是 CD3+CD4+细胞,因此可用 CD3+CD8-细胞群来确定 CD4+T细胞群。 FITC 标记 CD8, PE 标记 IL-4和, PE-CY5

38、标记 IFN-r , APC 或 PE-CY7标记 CD3。流式细胞仪要求:488nm 或 633nm (仅限 APC 染料光源, 525nm 、 575nm 、 675nm , 767nm 滤光片。、细胞增殖状态检测核增殖抗 PCNA 、 Ki67、 BrdUrd 用于衡量细胞增殖分裂状况,在评估肿瘤预后有重要意义。为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测。 FITC 标记 PCNA 或 Ki67或 BrdUrd , PE 或(并 PE-CY5标记细胞表面 标志物。流式细胞仪要求:488nm 或 633nm 光源, 525nm 、 575nm 、 675nm 滤光片。、染色体分析流式细胞仪染色分析运用两