微生物的生理生化实验实验报告

1、微生物的生理生化实验李 越201500140086组员：隋心怡、王运泽、徐承鹏2016/11/26一 实验目的掌握几种常用的生理生化实验方法并了解其原理。（1.证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中的重要作用。4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。5.了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。）二 实验原理1. 在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种 微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的

2、底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化 试验占有重要的地位。2. 淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质 分解才能被微生物吸收利用 ，胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内 。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精，双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉。 在淀粉培养基上培养用碘处理 ： 其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶3. 油脂的水解：在

3、油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说 明此中菌可产生分解油脂的酶4. 糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数 细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氢气、甲烷、二氧化碳等); 有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。 产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 5. IMVIC实验主

4、要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测的指标。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性（2）甲基红试验 （ MR ） ： 某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色转变为红色，即甲基红反应。大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性三实验材料菌种：枯草芽孢杆

5、菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌 培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内装有倒置的德汉氏小管） （糖发酵试验） ；蛋白胨水培养基（吲哚试验）；葡萄糖蛋白胨水培养基； 试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水等 仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管等四实验方法1.淀粉水解实验（1 ）倒平板：按照淀粉培养基配方配制固体淀粉培养基，灭菌，待培养基冷却至 50 左右，在酒精灯火焰旁倒平板，每组两个平板。 （2）用记号笔在平板底部划成四部分。 （3）接种：在无菌操作台上，将枯草芽孢杆菌、

6、大肠杆菌、变形杆菌和铜绿假单胞菌分别在不同的部分点种，注意仅用接种针接触极少面积的培养基，在平板的反面对应部分贴上标签，标签上分别写上菌名，以免混淆。 （4）培养：将平板倒置，在 28 温箱中培养两天。 （5）观察：取出培养基，观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板，观察培养皿中菌落周围是否有无色透明圈，若有无 色透明圈出现，说明淀粉已经被水解，为阳性，反之则为阴性。记录实验结果。2. 油脂水解试验 （1）倒平板：按照油脂培养基配方配制固体油脂培养基，灭菌，待培养基冷却至 50 左右，充分振荡，使油脂均匀分布，在酒精灯火焰下倒平板

7、，每组两个平板。 （2）用记号笔在在平板底部划成四部分。 （3）接种：在无菌操作台上将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌和铜绿假单胞菌分别划十字线 接种于平板相对应部分的中心，并贴好标签，标签上注明菌种的名称。 （4）培养：将平板倒置，在 28 温箱中培养两天。 （5）观察：取出平板，观察菌苔颜色，如果出现红斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。记录实验结果。 淀粉水解试验接种示意图 油脂水解试验接种示意图3. 葡萄糖发酵实验 （1）培养基的配制：按照糖发酵培养基配置葡萄糖发酵培养基，分装至试管中，用胶头滴管往德汉氏小管中注满培养基，再把德汉氏小管倒置放入试管中，注意不要让德汉氏小管中进入空气，每组3

8、只试管，灭菌。 （2）接种：待培养基冷却至常温时，取葡萄糖发酵培养基试管 1支接入大肠杆菌，再取另1支接入普通变形杆菌，接种后轻摇试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡，第3支不 接种，作为对照。在各试管外壁上贴上标签，标签上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。 （3）培养：把接种后的试管放在试管架上，把试管连同试管架放入培养箱中于 28 下培养两天。 （4）观察：观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡，并记录实验结果。4. 乳糖发酵实验 （1）培养基的配制：按照糖发酵培养基配置乳糖发酵培养基，分装至试管中，用胶头滴管往德汉氏小 管中注满培养基，再把德汉氏小管倒置放入试管中，注意不要

9、让德汉氏小管中进入空气，每组2只试管，灭菌。 （2）接种：待培养基冷却至常温时，在无菌操作台上，取乳糖发酵培养基试管 1支接入大肠杆菌，再另取1只接入普通变形杆菌，接种后轻摇试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。在各试管外壁上贴上标签，标签上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。 （3）培养：把接种后的试管放在试管架上，把试管连同试管架放入培养箱中于 28 下培养两天。 （4）观察：观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡，并记录实验结果。 5. 吲哚试验 （3）培养基的配制：按照蛋白胨水培养基配方配制培养基，分装至试管中，每组五只试管，在高压蒸气锅内灭菌。 （2）接种：待培养基冷却后

10、，在无菌操作台上将大肠杆菌接入 1 支蛋白胨水培养基，产气肠杆菌接入另1 支蛋白胨水培养基，剩余一只试管不接种，作为空白对照，贴好标签。 （3）培养：把接种后的试管放在试管架上，把试管连同试管架放入培养箱中于 28 下培养两天。6. 甲基红试验 （1）培养基的配制：按照葡萄糖蛋白胨水培养基配方配制培养基，分装至试管中，每组五只试管，在高 压蒸气锅内灭菌。 （2）接种：待培养基冷却后，在无菌操作台上将大肠杆菌接入 1支葡萄糖蛋白胨水培养基，产气肠杆菌 接入 1支葡萄糖蛋白胨水培养基，剩余一只试管不接种，作为空白对照，贴好标签。 （3）培养：把接种后的试管放在试管架上，把试管连同试管架放入培养箱中

11、于 28 下培养两天。 （4）观察：培养两天后后，将每支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入 2 滴甲基红试剂，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。观察试管内的颜色变化，并记录实验结果。五实验结果1. 淀粉分解实验菌种 阳/阴性 结论大肠杆菌 + 能水解淀粉枯草芽孢杆菌 + 能水解淀粉变形杆菌 + 能水解淀粉铜绿假单胞菌 不能水解淀粉大肠杆菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌变形杆菌淀粉分解试验结果2. 油脂分解试验 菌种 阳/阴性 结论 大肠杆菌 - 不可以水解油脂 枯草芽孢杆菌 - 不可以水解油脂 铜绿假单胞菌 + 可以水解油脂变形杆菌 - 不可以水解油脂3葡萄糖发酵实验 样品 大肠杆菌 变形杆菌

12、 空白 颜色变化 黄 黄 紫 是否产气 是 是 否 阴/阳性 + + - 结论 可以分解葡萄糖 可以分解葡萄糖 对照组 产酸产气 产酸产气4乳糖发酵实验样品 大肠杆菌 变形杆菌 空白颜色 紫 紫 紫是否产气 否 否 否阴/阳性 - - -结论 不分解 不分解 不分解 葡萄糖分解试验 乳糖分解试验5. 甲基红试验样品 大肠杆菌 产气杆菌颜色变化 变红 变黄阴/阳性 + -结论 大肠杆菌在培养 产气肠杆菌转化有机酸为期仍维持酸性ph 非酸性末端产物6. 吲哚试验样品 大肠杆菌 产气杆菌颜色变化 产生红色圈状区 无变化阴/阳性 + -结论 可分解色氨酸产生 不分解色氨酸 吲哚 甲基红试验 吲哚试验附录牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏 3g蛋白胨 10gNaCl 5g琼脂 1520g水 1000mlPh 7.07.212120min灭菌淀粉培养基蛋白胨 10gNaCl 5g牛肉膏 5g可溶性淀粉 2g水 1000ml琼脂 1520g12120min油脂培养基蛋白胨 10g牛肉膏 5gNaCl 5g花生油或香油 10g1.6中性红水溶液 1ml琼脂 1520g蒸馏水 1000mlPh 7.212120min注：1.不能使用变质油 2.调好ph再加中性红 蛋白胨水培养基蛋白胨 10gNaCl 5g蒸馏水 1000mlPh 7.612120min糖发酵培养基蛋白胨