细菌脱氢酶活性的测定

1、细菌休止细胞的制备及其脱氢酶活性的测定摘要 休止细胞又叫静息细胞，在研究微生物生理生化及新陈代谢中应用广泛，这种细胞 虽然处于休眠状态， 不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有氧化和发酵能力， 是测定细 菌脱氢酶活性的良好材料。本实验用 E.coli cVcc249 菌株作为实验材料，制备其休止细胞， 再加入四种同样浓度的TCA循环中的底物：乙酸钠、琥珀酸钠、a酮戊二酸及柠檬酸钠，比较和分析在相同浓度、不同底物的情况下，细菌脱氢酶活性的大小；并对其中的a酮戊二酸和柠檬酸钠两种底物配以浓度梯度， 研究其分别与细菌脱氢酶活性之间的相互影响。 在本 次实验中， 所采用的测定细菌脱氢酶活性的方法是噻唑

2、盐还原法， 噻唑盐宜与反应生成的还 原氢反应生成水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒， 可溶解于二甲亚砜中， 再根据其颜色变化的深浅， 用分光光度计测其 OD510nm 值，即可表示细菌脱氢酶的活性。AbstractThe resting cells, which are widely used in the study of microbial biochemistry and metabolism, are a kind of cells that are dormant ,not growth or reproduction. Those cells still contains a variety

3、 of enzymes as well as the capacity of oxidation and fermentation, thus make them good material of determining dehydrogenases activity. The experimental strain is E.coli cVcc249.Firstly,preparing the resting cells of the stain, then adding the four substates of TCA cycle with the same concentration,

4、 the four substates are: sodium acetate, sodium succinate, a-ketoglutaric acid and sodium citrate. These allow us to compare and analysis the bacterial dehydrogenase activity in those four same concentration substates. Secondly, making concentration gradient of a-ketoglutaric acid and sodium citrate

5、 perspectively, study their functions with bacterial dehydrogenase activity. In this experiment, we us the method of MTT reduction to determine the activity of dehydrogenase. The MTT can be reduced by the bacterial dehydrogenase, and the product is Formazan, which is a water-insoluble and blue-purpl

6、e crystalline. We can solute Formazan in DMSO, then the samples were checked by measuring spectrophotometrically at 510 nm, which can represent the activity of bacterial dehydrogenase.关键词休止细胞脱氢酶活性 a酮戊二酸柠檬酸钠噻唑盐1.引言1.1 休止细胞1.1.1 休止细胞的定义及特性休止细胞又称静息细胞，是把培养液中各种营养物质和生长因子洗去后悬浮在生理盐水 中培养一段时间， 以消耗内源营养物质， 呈饥饿状

7、态的细胞， 在研究微生物的生理生化及新 陈代谢中有广泛的应用。它的主要特性就是细胞虽然处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有 氧化和发酵能力， 在适宜条件下可再恢复生长， 多数可以在低温保存一定时间而不失活。 另 外休止细胞反应专一性强 ,可以提高底物转化率 ,不易染杂菌 ,可以减少产物对菌体生长及酶 合成的抑制，是研究无细胞制剂等的好材料。1.1.2 休止细胞的制备及注意事项制备：a. 培养细胞，以固体或液体培养，收获比较年轻的细胞，制成细胞悬液；b. 洗涤细胞，以适量洗涤液洗涤细胞，4000rmp离心10min，保留沉淀细胞，重复 2次;洗涤的目的是为了洗掉细胞表面的营养物质

8、。c. 悬浮细胞，以适量洗涤液将细胞悬浮起来，即得休止细胞悬浮；d. 保存细胞，将细胞悬浮液保存在普通冰箱中，12周不会失活。注意事项：a. 保藏菌种的活化是使用保藏菌种的第一步。活化的要求是使保藏菌种恢复旺盛的生命活动和显示其原有的代谢和生长性能。 因此， 保藏菌种的活化必须使用保藏菌种时所使用的 相同的培养基和培养条件， 或使用以保藏菌种生长和代谢最佳的培养基和培养条件，以使保藏菌种能迅速恢复其原有的代谢速率和生理特性。以便接下来制备休止细胞。b. 洗涤细胞时，菌落一般在培养基表面粘附不紧密，用生理盐水可以轻易洗涤下来。倘 若有部分菌落仍未脱落， 可用接种环轻轻刮擦， 注意尽量不要碰触培养

9、基而使其进入洗涤液 中。c. 在液体中静置培养和振荡培养时，一般用离心机来收集菌体。离心机收集细胞的条件一般随微生物的种类而不同，细菌一般用 5000rmp ， 10min 或者 9000rmp ， 5min 就做够了。 然后洗涤以出去所收集细胞中的培养基， 离心沉淀的细胞在加入洗涤液后，用玻璃棒小心搅拌使成均一的悬浊液，再离心分离。 洗涤后， 一般再悬浮在洗涤液中保存，有时也可直接保存除去上清液的沉淀细胞。1.1.3 休止细胞的应用a. 休止细胞是制备无细胞制剂及其材料的原料。由于休止细胞的制备比较容易标准化， 所以可用它定量地进行生理生化或代谢过程的研究。例如本实验中应用E.coli cV

10、cc249 的休止细胞测定酶活。b. 研究基质对微生物细胞呼吸的影响；比较不同菌种的呼吸强度，测定抑菌剂的作用大 小和速度。c. 研究某种营养物质的呼吸商。呼吸商简称R.Q.,指生物体在同一时间内，释放二氧化碳与吸收氧气的体积之比或摩尔数之比，即指呼吸作用所释放的 C02和吸收的02的分子比。由测得的呼吸商，推测该营养物质是否被完全氧化时所产生的CQ容量和所消耗 02容量之比。各种营养物质的碳、氧和氢的含量不同，所以氧化时消耗的02和产生的C02也不同，因而它们的呼吸商亦有差别。例如： 糖完全氧化时的呼吸商 =1；丙酮酸完全氧化时，呼吸商 =1.2。d. 探索新的生长因子。如果某菌种的休止细胞

11、氧化丙酮酸很慢，当加入酵母浸出物时氧 化速度加快， 而已知的生长因子都没有这种作用， 这就表明酵母浸出物中可能含有促进氧化 丙酮酸的新因子，如：硫辛酸就是用这种方法发现的。1.1.4应用休止细胞时的注意事项 ：经培养的微生物，不仅在某菌体细胞的表面，同时在该菌体细胞的内部也残留有营养物 质。为了去除这些物质， 在应用休止细胞以前，可在室温下通气或振荡，以消耗菌体细胞内 的营养物质，降低内源呼吸，避免在实验中产生误差。此外，休止细胞的应用也有局限性。 例如，研究微生物繁殖时所发生的各种变化 （如核酸的变化过程等） ，就不宜使用休止细胞。1.2 酶活性1.2.1 酶活性的定义酶活性是指酶催化一定化

12、学反应的能力。任何一个酶都有催化一定底物进行特定反应的能力，但是酶的催化能力的测定实际上只 能通过测定酶催化反应速度来实现。 酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。而 酶促反应速度可用单位时间内、 单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。 另外， 在 研究酶促反应时，底物一般是过量的，因此一般测定产物的增加量较合适些。由于酶催化反应速度受温度、pH、离子强度及底物等诸多因素的影响，我们所谓的酶活性都是只在特定的系统和条件下测到的反应速度， 因此在测定酶活性时， 一定要注明这些特 定的条件。即使同样的酶，甚至用同样的测定方法和同样的单位定义，由于条件稍有不同， 也会使测到的酶活性难以

13、比较。 因此，要比较各篇文献报道或者不同牌号制剂的某种酶活性 时，必须注意它们的单位定义和测定系统及条件，千万不能盲目比较。与酶活性相关的另一个概念是 “比活”，食指单位重量的蛋白质中所含的某种酶的催化活 性，是纯度量度，单位为 u/mg 。比活越高则酶越纯。1.2.2 酶活性的影响因素酶促反应速度受酶浓度和底物浓度的影响，也受温度、pH、激活剂和抑制剂的影响。a. 酶浓度对酶促反应速度的影响 ：一定范围内，酶促反应速度与酶分子的浓度成正比当底物分子浓度足够时 ,酶分子越多 ,底物转化的速度越快。b. 底物浓度对酶促反应速度的影响在生化反应中，若酶的浓度为定值，底物的起始浓度较低时，酶促反应速

14、度随底物浓度的增加而增加当所有的酶与底物结合生成中间产物后，即使在增加底物浓度，中间产物浓度也不会增加，酶促反应速度也不增加。C.温度对酶促反应速度的影响各种酶在最适温度范围内，酶活性最强，酶促反应速度最大在适宜的温度范围内，温度每升高10C，酶促反应速度可以相应提高 12倍.不同生物体内酶 的最适温度不同过高或过低的温度都会降低酶的催化效率 ，即降低酶促反应速度。d. pH对酶促反应速度的影响酶在最适pH范围内表现出活性，大于或小于最适 pH，都会降低酶活性主要表现在两个方面：改变底物分子和酶分子的带电状态，从而影响酶和底物的结合:过高或过低的pH都会影响酶的稳定性，进而使酶遭受不可逆破坏。

15、e. 能激活酶的物质称为酶的激活剂.激活剂种类很多，有无机阳离子；无机阴离子；有机化合物、还原性谷胱甘肽等 .能减弱、抑制甚至破坏酶活性的物质称为酶的抑制剂.它可降低酶促反应速度.酶的抑制剂有重金属离子、一氧化碳、硫化氢、表面活性剂等。1.3细菌脱氢酶活性的测定1.3.1脱氢酶脱氢酶（dehydrogenases）是一类催化物质氧化还原反应的酶，在酶学分类中属于第一大类。反应中被氧化的底物叫氢供体或电子供体，被还原的底物叫氢受体或电子受体。当受体是02时，催化该反应的酶称为氧化酶，其他情况下都称为脱氢酶。脱氢酶是已知酶中种 类最多的一类，其中以催化供体中醇基团（一CHOH）、醛、酮基团（一HC

16、O或一RCO及烷基因（一CH2CH2）脱氢的为最常见。天然受体主要有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）和细胞色素。大多数脱氢酶的天然受体是NAD+或NADP+（以下用NAD（P）+表示），例如苹果酸脱氢酶，异柠檬酸脱氢酶等。脱氢酶的底物经这类脱氢酶的催化使”人。（卩）+还原生成NAD（P）H。另一些脱氢酶以黄素为辅基，辅基在催化反应中进行氧化还原。例如琥珀酸脱氢酶， 还原型烟酰胺腺嘌岭二核苷酸（NADH）脱氢酶，胆碱脱氢酶等。 NADH以及一些直接以黄素为辅基的 脱氢酶的底物通过脱氢酶的催化最后通过细胞色素系统而被氧氧化，此时释放出的能量供机 体需要。它们

17、与细胞色素系统电子传递链的连接大体上可以用简单的图来表示（如下）NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶都含有黄素辅基。NADH脱氢酶的辅基是黄素单核苷酸（FMN），以非共价键与酶蛋白结合。琥珀酸脱氢酶的辅基是黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）,以共价键与酶蛋白的组氨酸结合。生物体中绝大多数氧化还原反应都是在脱氢酶及氧化酶的催化下进行。物质经脱氢酶催化氧化，最后通过电子传递链而被氧氧化， 此时通过氧化磷酸化作用生成腺苷三磷酸（ATF）,是异养生物体取得能量的主要途径。1.3.2酶催化活性测定的一般原理酶的催化活性的测定方法分为定性和定量两种：定性的方法包括组织化学和度纸测定等；定量的方法包括简单反应和偶联反应两

18、种。具体说来，酶催化活性定量测定的简单反应是指，直接测定酶催化前后产物的量的变化。如果酶催化的是一个简单的反应：s+ p，在底物大大过量的情况下，酶催化的反应初速度与酶量成正比，因此通过测定反应后底物的减少或者产物的增加就可能确定酶的催化活性。 由于底物量是大量存在的，只有在底物量显著减少时测定才能达到一定的精确性，所以一般大多数依靠测定产物的生成来确定酶的催化活性，这样可以提高灵敏度。 只有在产物测定十分困难或者底物测定特别方便且灵敏度要求不高时，才采用测定底物减少的方法。定量测定中的偶联反应的过程是：如果要测定的酶催化反应为A B则将产物 B与另一化合物 C反应，通过测定 C的变化来确定

19、B的量，进而在确定酶的催化活性。这其中 的化合物C通常是一种无色染料，通过与B反应后，被氧化成一定的颜色，即所谓的“指示剂反应”。本实验所用的方法即为偶联反应，指示剂为噻唑盐。1.3.3测定酶活性时的注意事项a测定反应初速度。酶催化反应的动力学表明，反应速度随着时间延长会越来越慢。如 果用分光光度计来测定酶活性，通过吸收值A来表示产物浓度，用A对时间t作图，只有在反应初期曲线才近似直线， 因此酶活性通常是在底物大大过量的情况下测定反应初速度来求 得的。b. 精确计时。由于反应速度是通过测定一定时间内底物或者产物量变化而求得的，因此计时的精确性十分重要。活性测定都要求用秒表精确计时，据不能象一般

20、化学分析那样将反应液保温一段大约的时间就算了。例如，如果保温需十分钟， 计时误差在定分钟， 则仅计时引起的测量误差就达 10%。c. 恒温。酶反应受温度影响很大，因此测定时必须严格恒温。反应要放在自动控制温度 的恒温水中或者恒温箱中，底物在与酶液混合之前应预保温若干时间，然后混合。d. 恒定缓冲液的pH和离子强度的要求。 有些酶对pH变化十分敏感，pH显著改变反应速度。另为，有时样品本身含的酸或碱会严重改变反应系统的pH,缓冲液缓冲不了其酸或碱造成的影响，在这种情况下，可设法事先将样品调到需要的pH值，再测定。而缓冲液的离子强度对反应速度的影响没有这么显著，变化范围可以稍微大些，但也应尽可能维

21、持恒定。e. 空白对照。用相同的空白对照，可以使得测量到的一系列值在比较大小时有同一标准， 是结果更具有可靠性。如果忽略空白对照，则可能会引起相当大的误差。1.3.4细菌脱氢酶活性的测定原理1911-1920年间，T.Thunberg氏先后报道了近 40种有机化合物为动物细胞组织所氧化。 其中以琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和柠檬酸氧化最快，并发明了测定氧化的方法，即Thunberg（桑泊）管法。1915年，Makaen , Zilue二人将此技术首先用于细菌脱氢酶活性测定的研究。细菌脱氢酶活性测定方法甚多，Thunberg管法较其他方法，如液体石蜡法、氯化三苯基四氮法TTC法更完善，重复性好，因而

22、更为常用。本实验所采用是噻唑盐还原法。噻唑盐是一种黄颜色的染料，能被脱氢酶产生的还原氢还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒， 并沉积在细胞中；二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒， 使 反应液呈现蓝紫色。控制底物与酶反应的时间一样，再用722分光光度计在510nm时测量各个反应液的0D5!。值，可间接表示脱氢酶反应速率，即脱氢酶活性。1.4 TCA循环与四种底物1.4.1 TCA循环总反应I J 11l-JCM|LCHiXADH-1-Fr- ',十i Hi¥一;(_片 1I< !i n )i rI l-t ：l > H Ic：>： cnriH+ HCHfLWHC -CH

23、FJi 码;.ftGMCCM.XICH-Zr* N.r> I.P > 1 / hADlH) H4成水分子并将释放出的能量合成ATRCH -二JCiNi HttJii.i - x.rxjuCf®廷幼誓tA JH+ +Acetyl-CoA + 3 NAD + FAD + GDP + F+ 3 H2O 宀 CoASH + 3 NADH + 3 H + FADH + GTP + 2 CO柠檬酸循环是在细胞的线粒体中进行的。丙酮酸通过柠檬酸循环进行脱羧和脱氢反应;羧基形成C02,氢原子则随着载体（NAD+、FAD）进入电子传递链经过氧化磷酸化作用，形也可以说A,柠檬酸循环不只是丙酮

24、酸氧化所经历的途径，也是脂肪酸、氨基酸等各种燃料分子氧化 分解所经历的共同途径。此外柠檬酸循环的中间体还可作为许多生物合成的前体。柠檬酸循环是两用代谢途径。a三大营养素的最终代谢通路。糖、脂肪和蛋白质在分解代谢过程都先生成乙酰辅酶乙酚辅酶 A与草酷乙酸结合进入三羧酸循环而彻底氧化。所以三梭酸循环是糖、脂肪和蛋白质分解的共同通路。b. 糖、脂肪和氨基酸代谢的联系通路。三羧酸循环另一重要功能是为其他合成代谢提供小分子前体。a-酮戊二酸和草酰乙酸分别是合成谷氨酸和天冬氨酸的前体；草酰乙酸先转变成丙酮酸再合成丙氨酸；许多氨基酸通过草酰乙酸可异生成糖。所以三羧酸循环是糖、脂肪酸(不能异生成糖)和某些氨基

25、酸相互转变的代谢枢纽。142 TCA循环特点(1) 在此循环中，最初草酰乙酸因参加反应而消耗，但经过循环又重新生成。所以每循环一次，净结果为1个乙酰基通过两次脱羧而被消耗。循环中有机酸脱羧产生的CC2,是机体中CO2的主要来源。(2) 在三羧酸循环中，共有 4次脱氢反应，脱下的氢原子以NADH+H+和FADH2的形式进入呼吸链，最后传递给 。2生成H2O,在此过程中释放的能量可以合成ATP(3) 乙酰辅酶A不仅来自糖的分解，也可由脂肪酸和氨基酸的分解代谢中产生，都进入三羧酸循环彻底氧化。 并且，凡是能转变成三羧酸循环中任何一种中间代谢物的物质都能通 过三羧酸循环而被氧化。所以三羧酸循环实际是糖

26、、脂、蛋白质等有机物在生物体内末端氧 化的共同途径。1.4.3乙醛酸循环图旷牝乙醛噩循环CMS为苹果盤合躍；HI为异柠様酸蟄合酶2 乙酰-CoA + 2 NAD + FAD 宀草酰乙酸 + 2 CoA-SH + 2 NADH + FADH+ 2 H+此途径只存在于植物和微生物中。其主要内容是通过乙醛酸途径使乙酰-CoA转变为草酰乙酸，进而以生成的琥珀酸进入柠檬酸循环。具体过程为：草酰乙酸经乙醛酸循环体与乙酰辅酶A缩合成柠檬酸。但线粒体中的草酰乙酸不能透过线粒体膜，必须在天冬氨酸氨基转移酶作用下接受谷氨酸分子的a氨基形成天冬氨酸，才能跨越线粒体膜并进入乙醛酸循环体。 在乙醛酸循环体内， 天冬氨酸

27、再经天冬氨酸氨基转移 酶的作用将氨基转移到a酮戊二酸分子上，本身形成草酰乙酸后，才能与乙酰-COA结合形成柠檬酸。 柠檬酸异构化形成异柠檬酸， 与柠檬酸循环不同的是异柠檬酸不进行脱羧， 而是 经异柠檬酸裂合酶裂解成为琥珀酸和乙醛酸。乙醛酸与另一分子乙酰COA 在苹果酸合酶催化缩合形成苹果酸， 苹果酸穿过乙醛酸循环体膜进入细胞溶胶， 由苹果酸脱氢酶将其氧化为 草酰乙酸。在乙醛酸循环中，两个关键酶为异柠檬酸裂合酶和苹果酸合酶。另外，细胞溶胶中的草酰乙酸可经糖异生转变为葡萄糖。异柠檬酸裂解产生的琥珀酸又可跨膜进入线粒体，通过与柠檬酸相同的途径形成草酰乙酸，同时将2分子NAD+和1分子的 FAD 还原

28、。144四种底物与TCA循环关系a柠檬酸钠:TCA反应开始时，草酰乙酸与乙酰-CoA缩合形成柠檬酸，由柠檬酸合酶催化， 柠檬酸再异构成异柠檬酸， 以进一步氧化。 柠檬酸是柠檬酸合酶底物之一的草酰乙酸的竞争 性抑制剂，柠檬酸浓度的下降又促使柠檬酸的合成。若由此步进入TCA循环，共产生2NADH和 1FADH2。b. a酮戊二酸：由异柠檬酸氧化脱羧形成，中间产物是草酰琥珀酸。在有些细菌体内， 异柠檬酸的转变有两条途径。当需要能量时，即进行氧化脱羧形成a酮戊二酸；当能量贮备充裕时，异柠檬酸裂解为琥珀酸和乙醛酸，由异柠檬酸裂解酶催化。另外，a酮戊二酸脱氢酶受产物NADH和琥珀酰-CoA的抑制，如果NA

29、DH的浓度下降，a酮戊二酸脱氢酶的活性 也必然升高。若由此步进入 TCA循环，共产生1NADH和1FADH2。C.琥珀酸钠；a酮戊二酸氧化脱羧形成琥珀酰 -CoA，由a酮戊二酸脱氢酶催化，是一步不可逆反应；接着琥珀酰-CoA转化成琥珀酸并产生一个高能磷酸键。若由此步进入TCA循环，共产生 1NADH 和 1FADH2。d. NaAc:乙酸是通过乙醛酸途径进入 TCA循环的，具体反应是，乙酸通过乙酰-CoA合成酶变成乙酰-CoA,再通过乙醛酸途径变成草酰乙酸，由乙醛酸循环中产生的琥珀酸进入TCA循环，生成草酰乙酸，完成一次循环。整个循环过程可以看做是将两个乙酰-CoA 分子转变为一分子草酰乙酸，

30、同时将 2NAD+和1FAD还原。1.5 酶促反应动力学分析1.5.1 米氏方程 酶活性可通过酶在特定条件下的反应速度来表示,底物浓度是影响酶促反应速度的一个 重要因素。 在其它因素保持不变的情况下, 底物浓度对反应初速度影响的作用呈现矩形双曲 线。在底物浓度很低时, 反应速度随底物浓度的增加而急骤加快, 两者呈正比关系,表现为 一级反应。 随着底物浓度的升高, 反应速度不再呈正比例加快, 反应速度增加的幅度不断下 降。如果继续加大底物浓度,反应速度不再增加,表现为零级反应。此时,无论底物浓度增 加多大,反应速度也不再增加, 说明酶已被底物所饱和。 所有的酶都有饱和现象, 只是达到饱和时所需底

31、物浓度各不相同而已。米氏方程（Michaelis-Menten Equation ）是描述这种非变异构酶促反应的起始速度V与底物浓度S关系的方程。米氏方程：V0 :酶促反应初速率；Vmax：酶促反应在实验条件下达到的最大速率，是Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度；Km：米氏常数，酶的特征常数；S:底物浓度。在本实验中，琥珀酸钠与酶活性的关系符合米氏方程。催化琥珀酸钠反应的酶是琥珀酸脱氢酶，与FAD的关系是以共价键互相连接，因此它们是酶和辅基的关系。且琥珀酸脱氢酶不是变构酶，其活性不受产物FAD勺反馈抑制。因而当琥珀酸浓度在一定范围内时，其活性随着琥珀酸浓度的增加而增加，曲线呈上升趋势；当琥珀

32、酸浓度高于某值时，由于底物浓度过量，远远大于酶量，由V=Vmax S/（Km+S）可知，其反应速率V= Vmax,因而表现为平滑的直线。1.5.2酶的变构调节a反馈抑制。是一种负反馈机制，其中酶促反应的末端产物可抑制在此产物合成过程中 起作用的酶。这种抑制具有协同性、积累性和序贯性。b.酶活性调节的分子机制。酶活性调节的分子机制主要有两种：别构调节（酶分子构象发生改变），酶分子的化学修饰（酶分子结构发生改变）。别构酶能够调节其催化活性，它们具有的共同特性：别构酶含多个亚基；别构酶分子中含有两个中心，即催化中心和调节中心，它们在空间上是分开的， 可以在不同的亚基上， 也可以在同一亚基的不同部位上

33、；每个别构酶分子可以结合一个或多个配体（底物和效应物）,理论上结合底物的最大数目与催化中心的数目相等，结合的效应物的最大数目应与调节中心的数目相等；配体和酶蛋白的不同部位（或亚基）结合时，可在底物-底物、效应物-底物、效应物-效应物之间发生协同效应， 此效应可促进或抑制；因别构酶有协同效应， 故底物（S）对反应速度（V）的动力学曲线不是双曲线，而是S曲线（正协同）或表现双曲线（负协同），二者都不符合米氏动力学。在本实验中，异柠檬酸脱氢酶是一个别构调节酶，这也解释了为什么柠檬酸与脱氢酶之 间的相互作用不符合米氏方程的原因。异柠檬酸脱氢酶的活性受 ADP变构激活。ADP可增强酶与底物的亲和力。该酶

34、与异柠檬 酸、Mg2+、NAD+、ADP的结合有相互协同作用。与 NAD+、ADP的作用相反、NADP、ATP 对该酶起别构抑制作用。NAD+的含量升高，不仅有利于柠檬酸脱氢酶，对其他需要以NAD +为辅助因子的酶促反应也有推动作用。 异柠檬酸脱氢酶所具有的这些性质， 使它在柠檬酸循 环中起到调节酶的作用。 当柠檬酸浓度在一定范围内的时候， 产物的抑制作用没那么强， 随 着底物浓度的升高， 酶的活性逐渐增强， 反应速度随底物浓度的增加而增加； 当柠檬酸浓度 高于某值时，产物 NADPH和ATP积累到一定程度，则会使异柠檬酸脱氢酶发生变构，活性 降低， 使反应减慢， 随着柠檬酸浓度的继续增加，

35、变构抑制作用便会增强， 因此酶活性会随 之下降，最后形成钟罩型曲线。2. 材料和方法2.1 材料2.1.1 实验菌种E.coli cVcc2492.1.2 培养基完全液体培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCI 0.5g,蒸馏水100mL，pH 7.0（100mL，两瓶）完全固体培养基：按 2%加入琼脂2.1.3 试剂与仪器试剂：0.1M乙酸钠、0.1M琥珀酸钠、0.1M a酮戊二酸、0.1 M柠檬酸钠，PBS缓冲液（pH 7.0 :制悬浮液用，pH 7.4：配制噻唑盐时用），0.1M NaCI，噻唑盐（终浓度为 5mg/mL）,二 甲亚砜。PBS缓冲液配方（1L）: NaCI 8g, K

36、CI 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g仪器：试管，三角瓶，5mL离心管，移液枪，枪尖（1000mL , 200mL）,天平，称量纸，玻璃棒，接种环，酒精灯，振荡器，离心机，振荡培养箱，恒温箱，722分光光度计 。2.2 方法2.2.1 菌种的活化和扩大培养a. 无菌操作，将E.coli cVcc249保藏菌种转接到试管完全固体培养基斜面，37C培养1824h。b. 无菌操作，选取生长良好的活化菌种转接到含有完全液体培养基的三角瓶中，在振荡培养箱中，37C培养 1618h （OD600>1.0）。2.2.2 休止细胞的制备a. 将三角瓶中的菌体倒入离心管中

37、，4500rpm, 10min，收集沉淀。b. 0.1M的生理盐水洗涤沉淀三次，每次4500rpm , 10min。以洗掉细胞表面的营养物质。c. 用pH 7.0的磷酸缓冲液（PBS） 1020mL （用量根据使菌体数量而定）制备菌悬液。在 本次实验中，本组加了 15mL PBS 。d. 将制成的菌悬液放入0C冰箱，72hr。再放到37摄氏度恒温箱中48hr，以降低内呼吸。 休止细胞即制得。2.2.3底物的配制a. 分别配制浓度为0.1M的四种底物：乙酸钠、琥珀酸钠、a酮戊二酸和柠檬酸钠。b. 配制琥珀酸钠的浓度梯度:0.1M、0.1/10 M、0.1/20 M、0.1/30 M、0.1/40

38、 M。C.配制柠檬酸钠的浓度梯度:0.1M、0.1/2 M、0,1/3 M、0.1/4 M、0.1/5 M、0.1/10 M、0.1/15M、0.1/20 M、0.1/25 M。2.2.4酶与底物反应（每组实验平行三次）（浓度见结果）对于每个酶与底物的反应：在5mL的离心管中，加入0.4mL的休止细胞+1mL底物+40uL噻唑盐，振荡混匀，在 37C下反应12hr （反应时间试指示剂的变色程度而定，但一定要确 保每个离心管中酶和底物的反应时间相同）；反应完后，再离心管中加入1.3mL的二甲亚砜，混匀振荡，并在37 C恒温箱中保温30min，以终止反应。注：为了确保每个离心管中的酶和底物反应时间

39、相同，比如说都为1.5hr，可将离心管排成一排，先都加上底物，再加休止细胞的时候， 各个离心管间间隔时间为5s；在终止反应时，也已同样的顺序加入二甲亚砜，时间间隔同样是5s。2.2.5 测定 OD510值a. 以蒸馏水为空白对照，调节分光光度计：波长为510nm，吸光值为0,透光值为100。b. 先测试一个样品的吸光值，若吸光值大于0.7,则在每个样品中都加入适量的PBS（ pH 7.0）缓冲液，混匀，以使每个样品最终测量值都在0.20.7之间（因为本分光光度计敏感的测量范围在0.20.7之间）。c. 测定各个样品的OD510值，并做好实验记录。3.结果表一：大肠杆菌休止细胞与各种底物反应后测

40、得的OD510nm值浓度/MOD510nm 值柠檬酸钠的统统稀释浓度的影响ABC平均值0.10.5920.5950.5890.5920.050.6050.6060.6050.6050.0330.6170.6160.6150.6160.0250.6120.6160.6130.6130.020.5830.5830.5890.5850.010.5710.5690.5700.5700.00670.5600.5560.5690.5650.0050.5640.5560.5620.5640.0040.5630.5580.5590.560琥珀酸钠的不同稀释浓度的影响浓度/MABC平均值0.10.7130.70

41、90.7090.7100.010.7130.7100.7130.7120.0050.5970.5950.5980.5970.00330.5440.5470.5450.5450.00250.5350.5390.5400.538冋一浓度不冋底物对细胞脱氢酶活性的影响(0.1 M)PBS缓冲液0.5330.5350.5330.534NaAc0.5210.5270.5230.524a-酮戊二酸0.4620.4660.4650.464在origin和excel上作图得一下结果:0.62-0610 6Q0 020 100 QcMode)EqBtn、“3 ATflApt-0.5"(>Rdue

42、ed Chi3 449(13F-ftMl R-SquarQB372VillusSlndand ErrOD&lQnmyoQ.56S1Q QW770051 Onmxc0 03750 0013*OD&lQnm理0.014S000212QDSlOnmODSlOnmAFWHM006S4 0 034&60 00591QDiOnm0.W243 OD510rimGaussAmp Frt ot Sheetl 0051 Qnm柠棣酸餉浓度(mol/L)图1大肠杆菌脱氯爾活力船柠檬股钠浓度的变化EUQLg 00ModelHNIEquationy»Vma!<*xAn/(k*n

43、*x*n)Reduced Chn S.4334E-4SqrAdj.R-Sauare 0.8716ValueStarHjrtlEfrOOD SlOnmVmax0.73090 02742OD 510nmk0.001012.24723E-4OD 510nmn100 .0 000 026040 060080J0琥珀僧浓度mol/L)N2人肠朴谕脱包悔淸力随琥珀酸浓度的变化0.7120.70.70.6g.e0.5& 50.4a 40.3a J0.2a j0.120.80O D.3fWmC.71I0.5610.523666667寸占艺-眾至畫二 I柠檬酸钠琥珀酸缶開肚陋乙酸钠j史M為逍酮戊二酸口歸

44、&匪貯0.464333333柠檬酸钠琥珀酸-乙酸钠"丸二蟹酮戊二酸4.分析4.1大肠杆菌脱氢酶活性随柠檬酸钠浓度的变化从图1中可以看到，曲线呈钟罩型，即柠檬酸钠浓度在一定范围内时，大肠杆菌脱氢活性随其浓度的增加而增加；但当柠檬酸钠浓度达到0.04M时，大肠杆菌脱氢酶活性随其浓度的增加而降低。可以看出，当柠檬酸钠浓度在0.04M左右时，是细菌脱氢酶活性最适的浓度范围。产生这种现象的原因：当加入的底物为柠檬酸钠时，柠檬酸经乌头酸酶催化作用，产生一系列的构象的变化， 变为异柠檬酸后， 在异柠檬酸脱氢酶的作用下， 异柠檬酸的仲醇氧化 成羰基，再脱羧形成a酮戊二酸、NADH和CQ，为不

45、可逆反应，也是TCA循环中的限速步骤。 而异柠檬酸脱氢酶是一个别构调节酶，活性受ADP变构激活。ADP可增强酶与底物的亲和力。该酶与异柠檬酸、Mg2+、NAD +、ADP的结合有相互协同作用。与NAD+、ADP的作用相反、NADH、ATP对该酶起别构抑制作用。NAD+的含量升高，不仅有利于柠檬酸脱氢酶，对其他需要以 NAD +为辅助因子的酶促反应也有推动作用。当柠檬酸浓度在一定范围内的时候 （小于0.04M ），产物的抑制作用没那么强，随着底物浓度的升高，酶的活性逐渐增强，反应速 度随底物浓度的增加而增加，因而曲线呈现上升趋势；当柠檬酸浓度高于0.04M时，产物NADPH和ATP积累到一定程度

46、，则会使异柠檬酸脱氢酶发生变构，活性降低，使反应减慢，随着柠檬酸浓度的继续增加， 变构抑制作用便会增强， 因此酶活性会随之下降， 曲线呈现下 降趋势。所以柠檬酸钠浓度与细菌脱氢酶活性的关系会呈现钟罩型曲线。将实验数据用origin8.1作图，并用Gauss函数拟合，拟合曲线的卡方为 3.44903x 10-5,相 关度（R2）为0.9372,可以看出数据偏离非线性分析的结果不大。4.2 大肠杆菌脱氢酶的活性随琥珀酸钠浓度的变化从图 2可以看出, 曲线是双曲线, 符合米氏方程曲线。即琥珀酸浓度在一定范围内时,大 肠杆菌脱氢酶活性随其浓度的增加而增加；当琥珀酸浓度到达0.03M时，随着其浓度的增加

47、，大肠杆菌脱氢酶活性基本保持恒定水平。可以看出，当琥珀酸浓度在0.03M时，酶的活性达到最大,之后即使底物浓度再有增加,酶活性也基本保持不变。产生这种现象的原因：在 TCA循环中，琥珀酸会在琥珀酸脱氢酶的作用下生成延胡索酸 和F ADF2。琥珀酸脱氢酶与柠檬酸循环中的其他酶不同，是唯一嵌入到线粒体内膜的酶，是 线粒体内膜的一个重要组成部分, 其他酶通常存在于线粒体基质上。 琥珀酸脱氢酶催化琥珀 酸的脱氢具有严格的立体专一性。并且它是以FAD乍为其脱下电子的受体而不是NAD+，其与FAD勺关系是以共价键互相连接，因此它们是酶和辅基的关系，而且这个辅基是一种修饰形 式，其8a位碳原子与酶的组氨酸残

48、基相连。由此可见，琥珀酸脱氢酶不是变构酶，其活性不 受产物FAD勺反馈抑制。因而当琥珀酸浓度在0.03M之前时，其活性随着琥珀酸浓度的增加而增加，曲线呈上升趋势；当琥珀酸浓度高于0.03M后，由于底物浓度过量，远远大于酶量， 由米氏方程V=Vmax S/（Km+S），反应体系中S»E，当S很高时所有酶都被底物所饱和形成 ES 即E=ES则酶反应速率 V=Vmax , Vmax=k E s/ （Km + S） =k E，取决于酶的浓度，因 而酶活性保持不变状态。将实验数据用origin8.1作图，并用Hill函数拟合，取n=1后，拟合的曲线：卡方为 9.4334 x 10-4，相关度（

49、R2）为0.87188，可以看出数据偏离非线性分析的结果不大；另外，从拟合 的结果可以看出，在底物为琥珀酸钠的情况下，脱氢酶的Km值为0.101X 10-3mol/L, Vmax为 0.73689。4.3同样浓度下四种不同底物对脱氢酶活性的影响乙醛酸循环和TCA循环之间的关系如下图显示t biIl ICOOLtHaLI：厂 US-CuA'、 g(XX)coo-SCo A乙(ft Cl讷CHjIH( - < ( KJ(coo纯h爪CHjICH1 fC (K)I?叱權+10乙醛酸和TCA!环总图由图3可知，脱氢酶活性在四种底物下的大小顺序为：琥珀酸钠柠檬酸钠 乙酸钠 帖酮戊二酸。这是由它们各自进入 TCA1环的顺序和产生还原氢的能力所决定的。由反应过程可以看出， 琥珀酸、乙酸、a酮戊二酸在循环过程中都产生 1FADH2和1NADH, 它们对酶活性的影响就主要取决于它们进入TCA循环的顺序。由于产生 FADf是在琥珀酸脱氢生成延胡索酸这步完成的，产生NADH是在苹果酸脱氢生成草酰乙酸这步完成的，即它们都是在相同的反应中产生还原氢的，而由图可知，在这三种底物中，琥珀酸是最先进行脱氢的，因而其酶活性最高，但乙酸和a酮戊二酸的先后顺序就无从比较了。至于柠檬酸对酶活性的影响，虽然它在TCA循环中产生2NADH和1