磁珠分选原理及应用ppt课件

1、1/1 MD0 xxx.01Miltenyi Biotec: 免疫磁珠分选技术及应用免疫磁珠分选技术及应用1MD0197.02内容内容 MACS技术原理技术原理 MACS技术设备及分选策略技术设备及分选策略 几种特殊的几种特殊的MACS分选分选 分选和分析分选和分析DC细胞细胞 分选各种分选各种T细胞细胞 分选和分析细胞因子分泌细胞分选和分析细胞因子分泌细胞 分选造血干细胞分选造血干细胞 分选人类肿瘤细胞分选人类肿瘤细胞 分选和分析凋亡和死亡细胞分选和分析凋亡和死亡细胞 分选转染细胞分选转染细胞 分子生物学和蛋白生化的分选分子生物学和蛋白生化的分选2MD0347.01MACS技术原理技术原理M

2、ACS(Magnetic Activated Cell Sorting)：=免疫学免疫学+细胞生物学细胞生物学+磁力学磁力学 基于抗体对抗原的特异性识别基于抗体对抗原的特异性识别 磁性微珠直接或者间接偶联在抗体上，从而与细胞相连磁性微珠直接或者间接偶联在抗体上，从而与细胞相连 在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的3MD0651.01MACS 磁性分选磁性分选MACS微珠进行微珠进行磁性标记磁性标记未标记的细胞未标记的细胞先行流出先行流出洗脱阳性分洗脱阳性分选的细胞选的细胞4MD0197.02分选前标本制备：过滤分选前标本制备：过滤MACS预选滤器

3、：预选滤器：30 m 5MD0197.02MACS 技术技术设备与试剂设备与试剂 MACS微珠微珠 MACS分选柱分选柱 MACS 分选器分选器 详细分选方案详细分选方案*6+MACS微珠：微珠： MACS 微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒，可用于目的细胞的磁性标记。磁化微粒，可用于目的细胞的磁性标记。 +特性：特性： 50nm大小大小 对细胞没有毒性对细胞没有毒性 可生物降解可生物降解 不影响细胞特性不影响细胞特性 7MD0057.03MACS技术分选的技术分选的CD8+ T 细胞细胞微珠微珠8直标微珠直标微珠多选微珠多选微珠间标微珠间

4、标微珠9+MACS分选柱：分选柱： 填充有不同规格的铁珠。填充有不同规格的铁珠。 铁珠表面有亲水包被，不损伤细胞。铁珠表面有亲水包被，不损伤细胞。 无菌包装。无菌包装。 可用于分选多种细胞及亚细胞物质、可用于分选多种细胞及亚细胞物质、 细菌、病毒、细菌、病毒、mRNA和蛋白质。和蛋白质。+专利产品专利产品+将磁场扩大将磁场扩大100010000倍倍高纯度，高回收高纯度，高回收率率 10MD0061.02在在MS柱中产生的强大磁场柱中产生的强大磁场 11+MACS分选柱：12+MACS分选器：从手动到自动，从实验室到临床分选器：从手动到自动，从实验室到临床13+MACS分选器14autoMACS

5、分选仪分选仪 9种程序，一机完成所有细胞分选种程序，一机完成所有细胞分选 成本低，两个可重复使用的分选成本低，两个可重复使用的分选柱（柱（2周内周内100次）次） 快速（快速（310分钟）分钟）重复性好重复性好 全自动分选，仪器操作简单全自动分选，仪器操作简单 适用范围广：适用范围广：从少量标本（从少量标本（105）到大量标本（到大量标本（4X109），），进样量进样量0.5ml-50ml 8种全血微珠，可以做常见细胞的种全血微珠，可以做常见细胞的全血分选，省去了费时的提取单个全血分选，省去了费时的提取单个核细胞过程核细胞过程15MACS技术主要优势技术主要优势 小磁珠小磁珠: 50 nm（快

6、速、不活化细胞、不沉淀）快速、不活化细胞、不沉淀） 保留细胞功能（直接进行后续实验；无毒性；氧化保留细胞功能（直接进行后续实验；无毒性；氧化 铁和多聚糖组成，可生物降解）铁和多聚糖组成，可生物降解） 与流式细胞仪兼容（不影响细胞光学特性、不影响荧与流式细胞仪兼容（不影响细胞光学特性、不影响荧 光抗体标记、与流式细胞仪分选联合使用可以缩短流光抗体标记、与流式细胞仪分选联合使用可以缩短流 式分选时间）式分选时间） 快速、简便、无菌快速、简便、无菌 适用范围广（磁珠种类多、从少量到大量、适用于分适用范围广（磁珠种类多、从少量到大量、适用于分 选各种细胞、亚细胞物质）选各种细胞、亚细胞物质）MD004

7、3.0216MACS 细胞分选策略细胞分选策略 阳性分选阳性分选 去除分选去除分选 去除分选后再阳性分选去除分选后再阳性分选 多重分选多重分选MD0044.0217MACS细胞分选策略细胞分选策略1 1、阳性分选：阳性分选：根据特异性标志分选细胞根据特异性标志分选细胞: 阳性分选是指目的细胞磁性标记阳性分选是指目的细胞磁性标记 后，作为阳性的标记组分直接分选出来。后，作为阳性的标记组分直接分选出来。 优点：优点： 高纯度，尤其是富集稀有的细胞高纯度，尤其是富集稀有的细胞 高回收率高回收率 操作简便、迅速操作简便、迅速MD0044.0218MD016102阳性分选策略阳性分选策略MACS 微珠磁

8、性微珠磁性标记标记未标记细胞先行流出未标记细胞先行流出将分选柱移将分选柱移出磁场，洗出磁场，洗脱阳性分选脱阳性分选细胞细胞19MACS细胞分选策略细胞分选策略2 2、去除分选：去除分选：去除分选是磁性标记非目的细胞，并将其从细胞混合物中去去除分选是磁性标记非目的细胞，并将其从细胞混合物中去 除，即未磁性标记的细胞为目的细胞。除，即未磁性标记的细胞为目的细胞。 去除分选策略适用范围：去除分选策略适用范围： 去除不需要的细胞去除不需要的细胞 缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞）缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞） 不需要抗体和目的细胞结合不需要抗体和目的细胞结合 需进一步通过阳性选择分

9、选细胞亚群需进一步通过阳性选择分选细胞亚群MD0044.0220MD0160.02去除分选去除分选磁性标记磁性标记分选未磁性标记细胞分选未磁性标记细胞21MACS细胞分选策略细胞分选策略3 3、去除分选后再阳性分选：去除分选后再阳性分选：即先去除非目的细胞，再进行阳性分选。即先去除非目的细胞，再进行阳性分选。 适用范围：适用范围： 非目的细胞也表达用来阳性选择目的细胞的抗原。非目的细胞也表达用来阳性选择目的细胞的抗原。 要分选非常稀有细胞，先去除非目的细胞再行阳性分选，要分选非常稀有细胞，先去除非目的细胞再行阳性分选， 可获得高纯度的目的细胞。可获得高纯度的目的细胞。 MD0044.02221

10、. 去除非去除非CD4+ T 细胞细胞。 用生物素化抗体混合物和抗生物素微珠间接磁性标用生物素化抗体混合物和抗生物素微珠间接磁性标记非记非CD4+ T 细胞细胞 磁性分选去除标记细胞磁性分选去除标记细胞 先行流出为先行流出为 CD4+ T 细胞细胞 2. CD25微珠直接磁性标记微珠直接磁性标记CD25+细胞细胞阳性分选靶细胞阳性分选靶细胞 CD4+ CD25+ 调节性调节性T滞留在分选柱上，离开磁场后滞留在分选柱上，离开磁场后洗脱下来洗脱下来去除后再阳性分选去除后再阳性分选CD4CD4+ +CD25CD25+ +双阳性细胞双阳性细胞23MD0652.01多选微珠标记多选微珠标记MACS 分选

11、分选磁性颗粒的酶解离磁性颗粒的酶解离终止解离反应终止解离反应根据第二标志根据第二标志进行磁珠标记进行磁珠标记MACS 分选分选MACS细胞分选策略细胞分选策略4 4、多选微珠：多选微珠：24MACS畅销机器与分选柱畅销机器与分选柱 MiniMACS starting kit：1个分选架、个分选架、1个个MiniMACS分选器、分选器、1盒盒MS分选柱、分选柱、1支价值支价值7500元试剂元试剂（15088元）：可做阳性分选、小量标本、间标去元）：可做阳性分选、小量标本、间标去除分选、分子生物学分选除分选、分子生物学分选 Mini&MidiMACS starting kit：1个分选架、

12、个分选架、1个个MiniMACS分选器、分选器、 1个个MidiMACS分选器、分选器、1盒盒MS分选柱、分选柱、 1盒盒LS/LD分选柱、分选柱、1支价值支价值7500元试剂元试剂（27838元）：可做阳性分选和去除分选元）：可做阳性分选和去除分选 MS分选柱：分选柱：1盒盒25个，个，2763元元 LS分选柱：分选柱：1盒盒25个，个，4356元元 LD分选柱：分选柱：1盒盒25个，个，5100元元 uMACS与与u或者或者M分选柱分选柱：分子生物学分选：分子生物学分选 VarioMACS分选仪分选仪 autoMACS自动分选仪自动分选仪、CliniMACS分选仪分选仪 MD0044.02

13、25MACS几种畅销磁珠与抗体几种畅销磁珠与抗体 专利产品：专利产品：CD133、CD303、CD304 特殊产品：人类特殊产品：人类DC系列：系列：BDCA-1(CD1c)、BDCA-2(CD303)、 BDCA-3(CD141)、BDCA-4(CD304) 小鼠小鼠DC系列：系列：mPDCA微珠与抗体微珠与抗体 干细胞产品：干细胞产品： CD133、CD271微珠与抗体微珠与抗体 细胞因子分泌细胞：细胞因子分泌细胞：CSA分选与分析分选与分析 TH2细胞：细胞： CD294(CRTH)微珠与抗体微珠与抗体 分选人类肿瘤细胞：上皮肿瘤：分选人类肿瘤细胞：上皮肿瘤：CK、HEA 非血液肿瘤：非

14、血液肿瘤：CD45去除去除 死亡细胞去除试剂盒死亡细胞去除试剂盒 分选转染细胞分选转染细胞 分选分选HIV病毒、病毒、mRNA、cDNA top ten：CD133、CD34、人人CD4+CD25+、小鼠小鼠CD4+CD25+ CD303/CD304、人类人类NK、小鼠小鼠CD11c、anti-PE 微珠微珠 小鼠干细胞试剂盒（系别阴性小鼠干细胞试剂盒（系别阴性CD117）、）、CD4/CD8 MD0044.0226主要竞争对手分析主要竞争对手分析 Dynal：大磁珠大磁珠 主要市场：主要市场：CD4、CD8等高频细胞，等高频细胞， 优势：价格优势：价格 劣势：回收率低（不能做低频细胞、弱表达

15、细胞分选）劣势：回收率低（不能做低频细胞、弱表达细胞分选） 磁珠必需剪切（耗时磁珠必需剪切（耗时细胞状态不佳）细胞状态不佳） 大磁珠（活化细胞）大磁珠（活化细胞） 我们的优势：纯度高、回收率高、细胞活性好我们的优势：纯度高、回收率高、细胞活性好 不活化细胞，不改变细胞功能不活化细胞，不改变细胞功能 省时、省细胞省时、省细胞 产品品种最多，有专利产品产品品种最多，有专利产品 有手动、自动、临床级产品有手动、自动、临床级产品 有强大的技术支持队伍有强大的技术支持队伍 很好的声誉，市场占有率最高很好的声誉，市场占有率最高 MD0044.0227主要卖点主要卖点 干细胞产品：人类：干细胞产品：人类：C

16、D133、CD34、MSC试剂盒（试剂盒（CD271） 小鼠：系别阴性试剂盒、小鼠：系别阴性试剂盒、CD117微珠微珠 定向分化培养基定向分化培养基 DC产品：产品： 人类：人类：BDCA-1、BDCA-2/4 小鼠：小鼠：CD11c NK产品：产品： 人类：人类：NK细胞阴选试剂盒、细胞阴选试剂盒、CD3/CD56 T细胞产品：细胞产品： CD4+CD25+调节性调节性T细胞（人和小鼠）细胞（人和小鼠） CSA系列系列 CD4、CD8微珠及阴选试剂盒微珠及阴选试剂盒 B细胞产品：细胞产品： CD19微珠及阴选试剂盒微珠及阴选试剂盒 肿瘤细胞分选：癌细胞富集试剂盒、肿瘤细胞分选：癌细胞富集试剂

17、盒、HEA微珠、微珠、CD45阴选阴选 单核细胞分选：单核细胞分选：CD14微珠及阴选试剂盒微珠及阴选试剂盒 间标微珠间标微珠 死细胞去除试剂盒死细胞去除试剂盒 预选滤器、预选滤器、FCR阻断剂、阻断剂、T细胞活化与扩增试剂盒细胞活化与扩增试剂盒 流式细胞仪抗体（价廉、包装量大、优质）流式细胞仪抗体（价廉、包装量大、优质） MD0044.0228识别识别DC和和DC亚群亚群 New(CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56)DC 亚群特异性标志亚群特异性标志: Blood Dendritic Cell Antigens29PE FITCAPCMACS 技术分选与分析小

18、鼠技术分选与分析小鼠DC细胞细胞 New30MACS 技术分选与分析大鼠技术分选与分析大鼠DC细胞细胞 NewMD0044.02Anti-DC(OX62) Anti-DC(OX62) 微珠微珠 用于从大鼠外周血、淋巴和非淋巴组织中分选或者去除OX62+DC。 单克隆抗体OX62识别表达于大部分大鼠DC上的整合素E2亚单位（分子量150kDa）。 两个主要的树突状细胞亚群：CD4/OX41双阳性和CD4/OX41双阴性亚群。 该抗原也表达于表皮TCR/+或/+的T细胞亚群和垂体前叶星状滤泡样（S100+）细胞的一个亚群，但在朗格罕氏细胞和巨噬细胞上不表达。 31MACS 技术分选与分析功能性技术

19、分选与分析功能性T细胞细胞MD0044.02T h 细 胞 （ C D 4 ）T c 细 胞 （ C D 8 ）调 节 性 T 细 胞 (C D 4 + C D 2 5 + )T C R r/d 细 胞 (T C R r/d 微 珠 )N K /T 细 胞 (C D 5 6 多 选 微 珠 C D 3 微 珠 )T 细 胞 亚 群N a iv e T 细 胞 (C D 4 5 R O 阴 选 )活 化 T 细 胞 （ C D 6 9 、 C D 2 5 、 C D 3 0 ）效 应 T 细 胞 （ C D 2 7 ）记 忆 T 细 胞 （ C D 4 5 R A 阴 选 、 C D 4 5 R

20、 O 阳 选 ）T h 2 细 胞 (a n ti-C R T H 2 )T 细 胞 功 能 亚 群IF N -rIL -2IL -4IL -1 0T N F -a抗 原 特 异 性 T 细 胞T 细 胞 分 选32MD0420.02MACS 细胞因子分泌细胞分析与分选细胞因子分泌细胞分析与分选 New抗原特异性抗原特异性再刺激再刺激细胞因子细胞因子分泌阶段分泌阶段捕获试剂捕获试剂标记标记荧光标记和荧光标记和磁性分选磁性分选Catch ReagentDetection AntibodyAnti-PE MicroBeadscytokine secreting cellsecreted cytok

21、ine33MD0420.02MACS 细胞因子分泌细胞分析与分选细胞因子分泌细胞分析与分选 New分选前分选前刺激组刺激组分选后分选后未刺激组未刺激组*百分比均为占百分比均为占CD4细胞百分比细胞百分比34MD0420.02MACS 细胞因子分泌细胞分析细胞因子分泌细胞分析New刺激组刺激组未刺激组未刺激组 使用PE- CMVpp65/HLA/A2- tetramers 和IFN-g Secretion Assay - Detection Kit (APC) or IL-2 Secretion Assay - Detection Kit (APC)检测 HLA/A2 CMV+ 患者PBMC。

22、*百分比均为占CD8细胞百分比35人类细胞因子分泌细胞人类细胞因子分泌细胞分选与检测试剂盒分选与检测试剂盒+IFN-g g 分泌细胞分泌细胞+IL-2分泌细胞分泌细胞+IL-4分泌细胞分泌细胞+IL-10分泌细胞分泌细胞+TNF- 分泌细胞分泌细胞小鼠细胞因子分泌细胞分小鼠细胞因子分泌细胞分选与检测试剂盒选与检测试剂盒 IFN-g g 分泌细胞分泌细胞 IL-2分泌细胞分泌细胞 IL-4分泌细胞分泌细胞 IL-5分泌细胞分泌细胞 IL-10分泌细胞分泌细胞36人类干细胞分选微珠与试剂盒人类干细胞分选微珠与试剂盒 CD34微珠及多选微珠：用于从骨髓、外周血、脐带血中分选微珠及多选微珠：用于从骨髓

23、、外周血、脐带血中分选 造血干细胞、内皮前体细胞造血干细胞、内皮前体细胞 CD133微珠微珠：用于从骨髓、外周血、脐带血中分选：用于从骨髓、外周血、脐带血中分选 造血干细胞、内皮前体细胞、多能成体干细胞（造血干细胞、内皮前体细胞、多能成体干细胞（MAPC） CD117微珠：微珠：用于从骨髓、外周血、脐带血中分选用于从骨髓、外周血、脐带血中分选 造血干细胞、骨髓间充质细胞造血干细胞、骨髓间充质细胞 CD45/GlyA去除分选试剂盒：用于从骨髓中阴选分选去除分选试剂盒：用于从骨髓中阴选分选 多能成体干细胞（多能成体干细胞（MAPC） CD105微珠：微珠：用于从骨髓中分选间充质细胞用于从骨髓中分选

24、间充质细胞 抗成纤维细胞微珠：抗成纤维细胞微珠：用于从骨髓中分选间充质细胞用于从骨髓中分选间充质细胞 多能成体干细胞（多能成体干细胞（MAPC） MSC分选工具（分选工具（CD271）new：用于从骨髓中分选间充质细胞用于从骨髓中分选间充质细胞 MD0044.0237成分成分:分选分选:CD271 (LNGFR)-APCAnti-APC MicroBeadsFcR Blocking 培养培养:NH Expansion Medium (2x500 mL)CytoMix - CD271 (LNGFR) 质量控制质量控制:NH AdipoDiff Medium (12x8 mL)NH OsteoDi

25、ff Medium (12x5 mL) Introductory offer38Ads in Blood (April & Mai)MSC Research Tool Box - CD271 (LNGFR)人类人类MSC的标准化研究的标准化研究CD271CD271又叫做低亲和力神经生长因子受又叫做低亲和力神经生长因子受体体(LNGFR), (LNGFR), 是迄今为止发现的最佳是迄今为止发现的最佳MSCMSC分选标志，可用于直接从人类骨髓中分分选标志，可用于直接从人类骨髓中分选选MSCMSC。分选后分选后CD271 (LNGFR)+ MSCsCD271 (LNGFR)+ MSCs是一群

26、均是一群均一的一的MSCMSC细胞群，而细胞群，而CD271CD271阴性细胞成分阴性细胞成分中没有成纤维细胞克隆形成单位中没有成纤维细胞克隆形成单位 (CFU-(CFU-F)F)活性。活性。 与贴壁培养的与贴壁培养的MSCMSC相比，相比，CD271CD271分选的分选的MSCMSC增殖能力增强增殖能力增强101010001000倍。倍。CD271CD271分分选和扩增的选和扩增的MSCMSC保留了多系分化潜能，保留了多系分化潜能，具有分化为脂肪细胞和成骨细胞、软骨具有分化为脂肪细胞和成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞的可塑性。细胞、内皮细胞的可塑性。cumulative population d

27、oubling (CPD)cumulative population doubling (CPD) 39Ads in Blood (April & Mai)MSC Research Tool Box - CD271 (LNGFR)人类人类MSC的标准化研究的标准化研究Nadia Quirici等，等，Experimental Hematology 30 (2002) 78379140MACSMACS小鼠干细胞分选试剂盒：小鼠干细胞分选试剂盒：Lineage Cell Depletion Kit:Lineage Cell Depletion Kit:去除成去除成熟和分化的造血细胞，预富集

28、造血干熟和分化的造血细胞，预富集造血干祖细胞。祖细胞。CD117 MicroBeadsCD117 MicroBeads：分选早期和晚期分选早期和晚期干祖细胞干祖细胞。 Anti-Sca-1 MicroBeadsAnti-Sca-1 MicroBeads：分选造血干分选造血干细胞和早期造血祖细胞。细胞和早期造血祖细胞。CD117+Sca-1+linCD117+Sca-1+lin细胞也有非造血分细胞也有非造血分化潜能，如分化为肌细胞、内皮细胞化潜能，如分化为肌细胞、内皮细胞、肝细胞、神经系统细胞。、肝细胞、神经系统细胞。 CD45/Ter119CD45/Ter119微珠去除分选骨髓细胞，微珠去除分

29、选骨髓细胞，可以得到可以得到MAPCs,MAPCs,也有体外分化为多种也有体外分化为多种细胞的潜能。细胞的潜能。小鼠骨髓造血干细胞小鼠骨髓造血干细胞 (HSC) (HSC) 定义定义为为 Sca-1Sca-1+ +、 CD117 CD117+ +(c-kit)(c-kit)、Thy-Thy-1 1low 和和linlin- -细胞细胞. .41MACS 技术分选人类肿瘤细胞技术分选人类肿瘤细胞 NewMD0044.02上皮肿瘤细胞上皮肿瘤细胞 根据表面抗原进行分选与分析：根据表面抗原进行分选与分析： Anti-HEA (EpCAM) MicroBeads Anti-ErbB-2 (HER-2/

30、neu) MicroBeads根据细胞内细胞角蛋白分选与分析：根据细胞内细胞角蛋白分选与分析：cytokeratin黑色素瘤细胞分选：黑色素瘤细胞分选： Anti-melanoma MicroBeads其它非造血系统肿瘤细胞其它非造血系统肿瘤细胞: CD45 MicroBeads去除白细胞去除白细胞骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞： CD138 MicroBeads霍奇金氏淋巴瘤霍奇金氏淋巴瘤/RS细胞：细胞： CD30 MicroBeads42MACS 技术分选凋亡细胞技术分选凋亡细胞 NewMD0044.02刺激、分化、凋亡、脱颗粒、坏死刺激、分化、凋亡、脱颗粒、坏死PS暴露暴露PS暴露细胞被暴露细胞被AnnexinV微珠磁性标记微珠磁性标记磁性标记细胞滞留在分选柱上磁性标记细胞滞留在分选柱上PS暴露细胞被洗脱下来暴露细胞被洗脱下来43M