亚硝胺诱发大鼠肝癌表达转化生长因子β与肥大细胞浸润的关系.

1、亚硝胺诱发大鼠肝癌表达转化生长因子3与肥大细胞浸润的关系【摘要】目的探讨肝癌转化生长因子3(transforming growthfactor3,TGF3)表达及与癌周肥大细胞(mast cell,MC)数量的相关性。方 法 二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌模型，应用光镜、电镜、免疫组织化学及细胞 像分析技术观察肝癌细胞 TGF3表达与癌周 MC 数量变化之间的关系。结果 肝癌细胞胞浆中 TGF3呈阳性表达，不同组别的大鼠肝癌 TGF3表达强度在 各癌巢间显示明显的差异，TGF3表达强弱与癌周 MC 数量变化呈平行一致关 系(PvO.01)。结论 肝癌细胞通过释放细胞因子 TGF3并以旁分泌方式影响

2、癌周 MC 的数量，TGF3是影响癌周 MC 数量变化的相关因素之一。【主题词】 肝肿瘤；转化生长因子3；肥大细胞Correlation study of TGF3expression in diethylnitrosamine-in duced rat liver can cer and mast cells in its vic inityZHENG Meiro ng, RUAN Youb ing, WU Zho ngbi.(Department of Pathology, Jiujiang Medical College, Jiujiang 332000, Chi na)【Abstrac

3、t 】 Objective To study the correlation between tumor cell expressionof TGF3and the amount of surrounding mast cells inhepatocarci nogen esis.MethodsHepatocarci onoma was in duced bydiethylnitrosamine(DENA) in rats. The expression of TGF3wasexam ined immun ohistochemically, and mast cells were ide nt

4、ified by Alcia n blue staining. The results were un derg one cell imag ing analysis. Results Positiveexpression of TGF3was observed in thecytoplasm of the hepatocarc inoma cells .The in ten sity of expressi on differd invarious groups of experime nt. There was a positive correlation between the inte

5、nsityof the TGF3expression inhepatocarci noma cells and the amount of mast cells surro unding the tumor nodules(Pv0.01). Con clusi onMast cell in filtratio n in DENA-in duced rat hepatoma may be due to the chemotactic effect of TGF3expressed in tumor cells.【Subject words 】Liver neoplasms;Transformin

6、g growth factor3;Mast cells肥大细胞(mast cell, MC )与肿瘤之间的关系倍受人们关注。有研究表 明，MC!过合成和分泌多种抗肿瘤物质，如酶、血管活性胺和肿瘤坏死因子(TNF-a)等对肿瘤细胞发挥毒性杀伤作用：1-3肝癌组织周围 MC 寸癌细胞生 长速度及癌基因表达均有明显抑制作用 。Ueda 等报道，肿瘤周围 MC 数量 与预后密切相关，肿瘤周围有大量 MC 聚集的患者，其预后远较肿瘤周围缺乏 MC#为好，并认为肿瘤周围 MC 数量多少实际反映了患者机体免疫力的强弱。 但对造成肿瘤周围 MC 数量差异的主要原因，文献报道极少。 我们利用二乙基亚 硝胺(di

7、ethylnitrosamine, DENA )诱发大鼠肝癌模型，应用光镜、电镜、免 疫组织化学和细胞像分析技术，探讨和分析转化生长因子B(transforminggrowth factorB,TGFB)在实验性肝癌中的表达及与癌周 MC 数量变化的相 关性，以期阐明影响肝癌周围 MC 数量变化的相关因素及可能机制。材料与方法1.实验性肝癌动物模型建立：实验动物由同济医科大学动物实验中心提供，DENA 由美国胡宗义博士赠送。健康雄性 SD 品系大鼠 55 只，体重 250300g,随机分为两组：实验组 50 只，对照组 5 只。实验组 SD 大鼠以 70 mg/kg 剂量的 DENA( 1%灌

8、胃，每周 1 次，连续 15 周后停药，同时喂以正常鼠料；对照组 SD 大鼠仅以正常鼠料喂养，20 周后处死。2. 标本的收集与处理：取新鲜实验组肝癌组织及对照组正常肝组织，分别 用 4%中性多聚甲醛及2.5%戊二醛固定， 分别做常规石蜡包埋和电镜包埋， 做 HE染色、 Alcianblue 染色和免疫组织化学染色，光镜和电镜观察。3. MC 特殊染色：选择 4 灿性多聚甲醛液固定、石蜡包埋的肝组织蜡块，制成 5 卩 m 厚的连续切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精后入水，2% Alcian blue 染液进行肥大细胞特殊染色，光镜观察。MC 计数：在光镜高倍视野下(X400)，对每张切片任意选择 5

9、个视野， 分别对其癌巢周围 MC 进行计数。+:每 5 个高倍视野下癌周 MC 平均数10 个； +：每 5个高倍视野下癌周 MC 平均数 1020 个；+:每 5 个高倍视野下癌 周 MC 平均数20 个。4. 透射电镜标本制备：新鲜病变肝组织，2.5%戊二醛固定 2 h，0.1 mol/L PB 冲洗，1%锇酸后固定 2 h，逐级酒精丙酮脱水，Epon 812 环氧树脂包埋、切 片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色， OPTON EM 10 透射电镜观察。5. 免疫组织化学染色：免疫组织化学染色采用SP 法，TGFB单克隆抗体购自德国 Boehringer Mannheim 公司，染色流程按

10、SP 法进行。6. 细胞像分析：HPIAS-1000 高分辨彩色病理文分析系统为同济千屏影像工 程公司产品。以测量窗口为固定的面积，计算出在同样窗口下阳性面积的面密 度(面密度=阳性面积/窗口面积)。主要过程：标本制备一获取数字化细胞像 -像二值分割一测量有关参数(面积、积分光度、平均光度)-统计学处理。7. 统计学处理：实验数据采用均数土标准差(土 s)，t 检验。结果1.光镜观察结果：诱癌第 20 周，断头处死动物，组织学显示肝细胞癌形 成。Alcian blue 染色显示，MC 呈蓝色，高倍镜下可见胞浆内分泌颗粒。对照组正常肝组织中，MC 数量极少，部分肝组织汇管区偶见 35 个；实验组

11、 MC 多 沿汇管区和癌巢周围密集分布。在不同大鼠肝癌周围，MC 数量不等，有的肝癌癌巢周围 MC 数量十分丰富，有的则很少。2. 电镜观察结果：MC 以其胞浆内含有大量电子致密颗粒为其特征。在肝组 织中不同区域内 MC 超微形态结构有一定差异：分布在汇管区、胆管周围 MC 核形多较规则，胞浆内颗粒丰富，呈均质性；位于血管周围或靠近肝癌细胞周围 MC 核膜多不规则，胞浆内颗粒相对较少，颗粒呈不均质性，并见有MC 兑颗粒现象（1，2）。3. 免疫组织化学结果：肝癌细胞胞浆中 TGFB呈阳性表达，为棕黄色颗粒。不同组别的大鼠肝癌 TGFB阳性反应强度在各癌巢间显示明显差异，TGFB阳性反应的强弱与

12、癌周 MC 数量变化呈平行一致关系，即具有丰富 MC 浸润的 癌巢中，TGFB阳性细胞数较多，几乎遍及整个癌巢，且染色一般较深（3，4）;相反，仅少量 MC 浸润的癌巢中，TGFB阳性细胞相对较少，染色反应亦 较弱。癌巢周围组织及正常肝组织 TGFB呈阴性反应。细胞像分析结果见表1。表 1 肝癌细胞 TGFB表达与癌周 MC 数量（ s）MC 计数TGFB阳性面积1平均光度积分光度MC+707 749.24 368.740.150.06 9.103.47MC+ 644 228.83 439.650.160.04 4.821.05注：MC+与 MC+匕较，PvO.011 分布于汇管区胆管周围的

13、MC 核形多较规则，胞浆内颗粒丰富透射电镜X2500（Be 示胆管上皮）2 靠近肝癌细胞周围 MC 核形多不规则，胞浆内颗 粒相对较少透射电镜X5000（?示肝癌细胞）3 肝癌细胞呈 TGFB阳性， 阳性表达部位位于胞浆，为棕黄色颗粒，核阴性SP 法X400 4 与上同一部位癌巢周围 MC 数量十分丰富（蓝色颗粒）Alcian blue 染色X400讨论TGFB是一个多功能细胞因子，能促进多种细胞分化、增殖、迁移及细胞 外基质合成与降解。MC 源于骨髓前体细胞，未成熟的 MC过血液迁移至外周 组织，并在外周组织微环境因子作用下分化成熟:6。本研究发现，肝癌细胞胞 浆中 TGFB呈阳性，不同组大

14、鼠肝癌 TGFB表达强度在各癌巢间差异有显著 性，肝癌细胞 TGFB表达强弱与癌周 MC 数量变化呈平行一致关系（P0.01）,即具丰富 MC 浸润的癌巢中，TGFB阳性细胞数多，几乎遍及整个癌巢，染色一般较深；相反，MC 浸润少的癌巢中，TGFB阳性细胞数相对较少，染色反应亦较弱。癌周 MC 数量的增加不仅与 MC 的分化、增殖有关，同时也与 MC 向局部迁移 有关。MC 的迁移离不开细胞因子的趋化作用，如 TGFB能趋化培养状态下的 小鼠 MC使 MC 发生迁移，在 25 fmol/L 迁移反应即可达到最大；TGFB也能 趋化新分离的大鼠腹腔 MC TGFB作用时所结合蛋白的相对分子质量为

15、 70 000 和 288 000 ,与 MC 表面 TGFB的I和川型受体分子量一致：刁。提示 TGFB是通过 MC 表面相应受体发挥作用的，与其他MC趋化因子，如 RANTESSCF 和 IL3、层黏素比较：8宀，TGFB是目前所知最强的趋化因子：10：。由于肝再生 时期的肝细胞是 TGFB的主要来源之一，因此有理由认为， 肝癌细胞产生的 TGFB被激活后， 可能通过旁分泌方式， 对癌周 MC的趋化、迁移等方面起到 重要作用。我们利用 DENA 诱发大鼠实验性肝癌，其结果显示，不同组别大鼠肝 癌癌巢中 TGFB表达强度差异与癌周浸润 MC 数量变化呈平行一致关系（PV0.01）。这一结果提

16、示，癌周 MC 数量与癌巢中 TGFB表达强度密切相 关，肝癌细胞分泌的 TGFB是影响癌周 MC 数量变化的相关因素之一，TGFB在癌周 MC的迁移、聚集中发挥了重要作用。（本文 14 见插页第 14 页）郑美蓉（江西省九江医学专科学校病理教研室332000）阮幼冰（同济医科大学超微病理研究室）武忠弼（同济医科大学超微病理研究室） 参考文献1，Henderson WR, Chi Y, Jong EC, et al. Mast cell mediated tumor cell cytotoxity: roleof the peroxidase system. J Exp Med, 1981，

17、153:520533.2， Gordon JR, Galli SJ. Release of both preformed and newlysynthesized tumor necrosis factora(TNF-a)/cachectin by mouse mastcells stimulated via the Fc?RI: a mechanism for the sustained action of mastcell-derived TNF-aduring IgE-dependent biological responses. J Exp Med,1991,174:103-107.3

18、，王先松，阮幼冰，武忠弼 . 肥大细胞对肝癌细胞毒性作用的体外实验研究 . 中华肿瘤杂志 , 1996,18:276-278.4，阮幼冰，武忠弼，杨木兰 ,等. 增殖细胞核抗原及表皮生长因子受体在大鼠 肝癌及胃癌中的表达 . 中华病理学杂志 ,1994,23:274-277.5， Ueda T, Aozasa K, Tsujimoto M, et al. Prognostic significance ofmast cell in soft tissue sarcoma.Cancer, 1988,62:2416-2419.6， Galli SJ. Biology of disease new insights into“the riddle