绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达

1、绿色荧光蛋白 (GFP) 基因的克隆和表达背景知识是一类存在于包括水母、水蛇和珊瑚等腔绿色荧光蛋白 (green fluoresce nt protein , GFP)GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时,底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的oGFP由3个外显子组成，长 2.6kb ; GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27. 0kMr ,其蛋白性质十分稳定，能耐受60C处理。1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm ,宽240 nm,由11个围绕中心a螺旋的反平行B折叠组成，荧

2、光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm,宽240 nm,由11个围绕中心a螺旋的反平 行B折叠组 成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的对荧光活性由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖, 很重要的生色团则位于大空腔内实验一质粒DNA的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒 DNAI取方法：碱裂解法。该法用于从小量培养物中抽提

3、质粒DNA,比较方便、省时，提取的质粒DNA 质量较高，可用于DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今 为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA 分子，分子量范围从1kb 到 200kb 。质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体 上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多数情况下质粒 DNA制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格 限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的

4、质粒的复制受宿主细胞的 控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达10-200 个拷贝。当宿主细胞的蛋白 质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理） ，细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒DNA可继续 被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒DNA用人为的方法转化 进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药 基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。质粒作为基因克隆载体分子的重要

5、的条件是获得批量的纯化的质粒DNA 分子。目前已有 许多方法可用于质粒 DNA 的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增； 菌体的收集裂解，质粒DNA的分离；质粒DNA 的纯化。1、 细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落， 接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。 对于松 弛型质粒 （ 如pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期,就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA 。但对于严谨型质粒（如 pBR322 ）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩2、菌体的收集、裂解和质

6、粒DNA勺分离质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种 主要性质差异：（1 ）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。（2）从细胞中提取得 到的大肠杆菌DNA 主体是变性的线性分子，而大多数质粒 DNA 是共价闭合的环状分子。这里主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入SDS （十二烷基硫酸钠）和 NaOH使菌体裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁） 。此处理可破坏碱基配对， 故可使细菌的线状染色体DNA 变性，但闭环质粒DNA 链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。 当条件恢复正常时 （如 加入酸性的 NaAc或Kac中和碱性NaOH ,质

7、粒DNA连迅速得到准确配对，重新恢复成天然的超螺旋分子。通过离心，可以3、质粒DNA 的提纯对于小量制备的质粒DNA ，经过苯酚抽提、 蛋 RNA 酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余白质及 RNA ，达到纯化的目的。质粒 DNA 分子具有三种构型：共价闭合环形构 DNA （cccDNA ， SC 构型）、开环DNA （OC型）和线性分子（ L 构型）。在细菌体内，质粒 胶电 DNA 是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝 泳中不同构型的同一种质粒最前沿的是NScDNA ，其 后依次是L DNA 和 OC DNA 。三、实验材料、仪器及试剂 使染色体 DNA 与变性蛋白质、 RNA 分子一起沉淀下来

8、，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。1.在含有pEGFP N3质粒的DHa平板上菌落上挑取菌种，置于含有5mL LB培养基的试管中。摇晃过夜。在含有 pET-28a 质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样摇荡培养过夜。 2 、 使用仪器恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合器，冰箱 四、 实验步骤 1. 取 1.5ml DH5 培养液倒入1.5mL eppendof 管中 , 13000rpm 离心 1min 。2 . 重复13 .弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。4 .菌体沉淀重悬浮于100n容液I中（需剧烈振荡），室温下放置10min。5 .加入新配制的

9、溶液n 200I,盖紧管口，快速温和颠倒eppendof管5次，以混匀内容物（千万不 要振荡）， 冰浴5min。6 .加入150 1预冷的溶液川，盖紧管口，弁倒置离心管，温和振荡3次，使沉淀混匀，冰浴中15分钟,13000rpm 离心 5min。7 .上清液移入干净eppendof管中,加入等体积的氯仿/异戊醇（24 : 1），振荡混匀,13000rpm离心2mino8 .将水相移入干净eppendof管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24 : 1）振荡混匀，13000rpm离心2min。9 .将水相移入干净eppendof管中，加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后，置于室温下 2min ,然后 13000rpm 离心 5min。10 .弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1mL 70 %乙醇洗沉淀一次，振荡混匀后，13000r