细胞分裂素代谢信号转导交叉反应与农艺性状改良

1、植物学通报2006, 23 (5: 478498基金项目:教育部新世纪优秀人才支持计划(杨淑华、国家自然科学基金委优秀创新团队(No. 30221002; 左建儒和杰出青年科学基金(No. 30125025; 左建儒These authors contributed equally to this paper.* Author for correspondence. E-mail: for Shuhua Yang: yangshuhua; for Jianru Zuo: jrzuo细胞分裂素:代谢、信号转导、交叉反应与农艺性状改良邓岩1,王兴春1,杨淑华2*,左建儒1*1中国科学院遗传与发育生

2、物学研究所, 植物基因组学国家重点实验室, 北京 1001012中国农业大学生物学院, 植物生理学与生物化学国家重点实验室, 北京 100094摘要 在高等植物中, 细胞分裂素通过对细胞分裂与分化的调节而广泛参与了对植物生长发育的调控。在过去的10余年, 利用模式植物拟南芥的研究, 在阐明细胞分裂素的代谢、转运与信号转导等方面取得了重要的进展。同时, 关于细胞分裂素与其它信号途径之间存在的广泛交叉反应也受到了人们的注意。根据我们现有的知识, 细胞分裂素信号转导是通过磷酸基团在一个双元组分系统之间的系列传递而完成的, 该过程被称之为“磷酸接力传递”(phosphorelay。细胞分裂素与其它信号

3、途径的互作可能也主要是通过双元组分系统链接的。双元组分系统中目前已知的主要信号元件不仅表现出功能冗余性, 同时在调控特定的植物生长发育过程时也具有特异性。本文在对细胞分裂素的代谢与转运过程简要评述的基础上,对其信号转导以及与其它信号途径间交叉反应的研究进展进行重点讨论, 并展望细胞分裂素研究对重要农业性状改良的意义。关键词 细胞分裂素, 信号转导, 双元组分系统, 交叉反应New Insights into Cytokinins: Metabolism, Signal Transduction,Cross Talks and Potentials in Agricultural Applica

4、tionsYan Deng 1, Xingchun Wang 1, Shuhua Yang 2*, Jianru Zuo 1*1State Key Laboratory of Plant Genomics , Institute of Genetics and Developmental Biology , ChineseAcademy of Sciences , Beijing 100101, China2State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry , China Agriculture University , Bei

5、jing100094, ChinaAbstract The plant phytohormone cytokinin regulates numerous growth and developmental processes by regulating cell division and cell differentiation. During the past ten years, remarkable progress has been made to our understanding on the cytokinin metabolism, transport and signalin

6、g, mainly using Arabidopsis thaliana as a model system. In addition, substantial attentions have also been paid to cross-talks between cytokinin and other signaling pathways. According to our current understanding, cytokinin signaling is mediated by sequen-tially transferring a phosphoryl group in d

7、ifferent members of a two-component system, referred to as phosphorelay. The two-component system may also act as a module linking cytokinin and other signaling pathways. Most known members of the two-component system are functionally redundant, but also show综述 . 细胞分裂素479 2006邓岩等: 细胞分裂素:代谢、信号转导、交叉反应

8、与农艺性状改良1955年, Miller等人在鲱鱼精子DNA热压水解产物中发现了一种可以促进植物细胞分裂与分化的物质, 将其命名为激动素(kinetin (Miller et al., 1955。随后, 一些有着相同生理活性的物质也陆续被发现, 它们被统称为细胞分裂素(cytokinins。早在发现之初, 人们便认识到细胞分裂素可以与生长素一起调节植物愈伤组织的分化, 并被广泛地应用到了植物组织培养技术中。随后, 细胞分裂素在调控顶端优势、主根伸长、维管束的形成、开花时间以及叶绿体发育中的功能也逐渐被人们发现 (Mok, 1994; Mok and Mok, 2001。长期以来, 虽然人们在遗

9、传学、生物化学以及生理学等方面进行了大量工作, 但对细胞分裂素的代谢、转运及信号转导等认识仍然有限, 主要原因是细胞分裂素与其它信号途径间存在着广泛、复杂的交叉反应, 细胞分裂素相关基因间的功能冗余以及缺乏特异性的生物学分析系统。直到1996年Kakimoto创造性地将“不定芽分析技术”(shoot regeneration assay 应用于对细胞分裂素相关突变体的遗传筛选和分析中, 状况才有所改善(Kakimoto, 1996。在近10年的时间里, 人们在细胞分裂素的代谢、转运、信号转导以及与其它信号途径间交叉反应的研究中都取得了重大的进展。本文将就上述研究进展做一简要的评述。1细胞分裂素

10、的代谢和转运细胞分裂素是一类具有腺嘌呤环结构的植物激素。在腺嘌呤环的第6位氮原子(N6上共价连接的不同取代基团产生了不同类型的细胞分裂素。根据N6基团上取代基团的不同, 细胞分裂素可分为类异戊二烯形式细胞分裂素和芳香环形式细胞分裂素等。1.1 细胞分裂素的生物合成在植物体内, 细胞分裂素主要以类异戊二烯的形式存在。目前已知的细胞分裂素生物合成途径有两个, 即从头合成途径和tRNA分解途径。现有的证据表明, tRNA途径只是植物体内细胞分裂素合成的次要途径, 而绝大部分内源细胞分裂素是由从头合成途径合成的(Haberer and Kieber, 2002(图1。人们对从头合成途径的最初了解来自于

11、从黏菌(Dictyostelium discoideum中鉴定出的一种酶,该酶可催化腺苷酸(AMP和二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP转化成有活性的细胞分裂素异戊烯基腺苷-5'-磷酸(isopentenyladenosine-5'-monophosphate, iPMP。该步骤是细胞分裂素生物合成的一个限速步骤 (Taya et al., 1978。随后, 在致癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens 中的致瘤Ti 质粒上克隆的异戊烯基转移酶基因 (IPT是第一个被克隆的编码细胞分裂素合成酶的基因。在农杆菌

12、的致瘤Ti质粒上有Tmr和Tzs两个IPT 基因(Akiyoshi et al., 1984; Barry et al., 1984。在之后10余年中, 对在植物细胞中是否具有类似的细胞分裂素从头合成途径一直没有定论。在拟南芥全基因组序列完成后, 两个研究小组独立发现拟南芥中共有9个IPT-类似基因,分别命名为AtIPT1到AtIPT9。生物信息学分析表明AtIPT2和AtIPT9在序列上与tRNA-IPT 更相似, 而其它7种AtIPTs与细菌IPT基因结构相似 (Kakimoto, 2001; Takei et al., 2001。其中, PGA22/IPT8基因的过量表达导致典型的细胞d

13、istinctive function in the regulation of a variety of developmental processes. In this review, we summarize our current understanding on cytokinin metabolism and transport, and discuss in detail on recent advances in cytokinin signaling as well as its cross-talks with other signaling pathways. We al

14、so make prospects on possible improvement of important agricultural traits by manipulating the cytokinin network.Key words cytokinin, signal transduction, two-component system, cross-talks48023(5图1 细胞分裂素的代谢IPT催化细胞分裂素生物合成的第一个限速步骤, 该酶可能优先利用ATP和ADP作为底物。植物体内的大部分iPMP来自于底物iP、iPR、iPTP和iPDP, 仅有少部分是由AMP经IPT催

15、化合成的。t-ZMP 可能主要由AMP和未知的侧链前体经iPMP非依赖途径合成, 也可由iPMP和t-ZDR合成。反式玉米素t-Z主要由iP形式的细胞分裂素羟基化形成, 细胞色素P450单加氧酶CYP735A催化了这一反应。iP和t-Z是细胞分裂素的活性形式, 二者及其核苷化衍生物iPR和t-ZR可被CKX不可逆地降解。iP和t-Z也可被细胞分裂素N-葡萄糖基转移酶(CKNGT不可逆的糖基化。t-Z还可以由tZOGT催化形成t-ZR, 该反应是可逆反应。而t-ZR的糖苷键可被-葡萄糖苷酶裂解而产生自由态的t-Z。玉米素可以在反式(t-Z和顺式(c-Z之间相互转换, 一般认为t-Z比c-Z的生物

16、学活性要高。上述反应共同调节细胞分裂素在体内的动态平衡。改编自参考文献(Astot et al., 2000; Kakimoto, 2003a; Takei et al., 2004; Sakakibara, 2006。Fig. 1 Cytokinin metabolismIPT catalyzes the first rate-limiting step in the cytokinin biosynthesis pathway, which may preferentially utilize ATP and ADP as substrates. Most iPMP is produced

17、 from iP, iPR, iPTP and iPDP, whereas a minor fraction is derived from AMP. t-ZMP may be mainly synthesized from AMP and an unknown precursor via the iPMP-independent pathway, and can also be derived from iPMP and t-ZDR. Trans-zeatin (t-Z is predominantly converted from the iP-type cytokinins, catal

18、yzed by the cytochrome P450 monooxygenase CYP735A. iP and t-Z are biologically active forms of cytokinin, which, together with their riboside-derivatives iPR and t-ZR, can be irreversibly degraded by CKX. iP and t-Z can be irreversibly converted to the inactive O-glucoside derivatives by CKNGT. In a

19、ddition, t-Z can also be reversibly converted to tZOGT, which, in turn, can be converted into t-ZR by -glucosidase. Zeatins have two isoforms, t-Z and cis-zeatin (c-Z, and t-Z is generally believed to be a more active form than c-Z. These interconversions regulate homeostasis of cytokinins in planta

20、. Adapted from refer-ences (Astot et al., 2000; Kakimoto, 2003a; Takei et al., 2004; Sakakibara, 2006.481 2006邓岩等: 细胞分裂素:代谢、信号转导、交叉反应与农艺性状改良分裂素反应, 例如根变短, 下胚轴变粗, 子叶深绿色等。进一步的研究发现, 在pga22突变体中, 异戊烯基腺嘌呤(isopentenyladenosine, iP的核苷酸形式iPMP和核苷形式iPR (isopenteny-ladenosine riboside的含量分别增加了19和38倍 (Sun et al.,

21、2003。上述结果表明, AtIPT8作为一个有功能的IPT在植物体内直接催化了iPMP的生物合成。类似的结果也发现于对AtIPT4 (Kakimoto, 2001、牵牛花 (Petunia hybrida (Zubko et al., 2002和蛇麻草 (Humulus lupulus (Sakano et al., 2004 等IPT基因的研究。在拟南芥中, 不同AtIPTs基因的表达模式不完全相同, 呈现不同的组织特异性, 表明细胞分裂素可能在植物体不同组织或部位合成(Miyawaki et al., 2004。由于以上细胞分裂素的合成途径都有一个共同的中间体iPMP, 因此被称为iPM

22、P依赖途径。近年来的研究表明, 在植物体内还存在着另一条细胞分裂素合成途径, 即iPMP非依赖途径。iPMP在内源羟化酶的作用下, 可转化成ZMP。然而在IPT转化拟南芥植株中, ZMP 的生物合成速率比由IPT 酶催化产生的iPMP 的生物合成速率高66倍 (Astot et al., 2000。此外, 同位素双示踪试验表明, ZMP 的主要前体不是细胞质中的iPMP, 可能是由AMP和一种未知的侧链前体合成, 而该途径受3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的抑制剂mevastatin的强烈抑制, 表明这种未知的侧链前体物质可能是类萜的衍生物 (Astot et al., 2000。对IPT

23、过表达转基因烟草的研究发现, ZR和ZMP的含量增加, 而iPMP的含量不受影响 (Redig et al., 1996或降低 (Eklof et al., 1996, 此结果也支持了iPMP 非依赖途径的存在。但在拟南芥中的研究也表明IPTs可能优先利用ADP和(或ATP, 而AMP可能不是细胞分裂素生物合成的主要底物或前体。因此, 有的研究者认为植物体内的绝大部分iPMP可能由下面3个途径产生: (1二磷酸异戊烯基腺苷(isopentenyladenosine-5'-diphosphate, iPDP或三磷酸异戊烯基腺苷iPTP (isopentenyladenosine-5

24、9;-triphosphate经磷酸化酶去磷酸化; (2核苷结合态细胞分裂素异戊烯基腺苷(isopentenyladenosine riboside, iPR经腺苷激酶而磷酸化; (3iPR经腺嘌呤磷酸转移酶结合上磷酸核糖基团 (Kakimoto, 2001; Takei et al., 2004。iP-形式的细胞分裂素也可以由细胞色素P450单加氧酶CYP735A1和CYP735A2羟基化后合成反式玉米素(trans-zeatin, t-Z(Takei et al., 2004(图1。1.2 细胞分裂素的降解与修饰近年来, 细胞分裂素的氧化分解作为调节细胞分裂素动态平衡的一种重要方式而得到广

25、泛关注。细胞分裂素氧化酶(cytokinin oxidase/ dehydrogenase, CKX首先是在玉米中发现的,能特异的降解细胞分裂素类异戊二烯侧链的不饱和键, 该反应是一个不可逆反应(图1(Houba-Herin et al., 1999; Morris et al., 1999。在兰花(Dendrobium orchid或拟南芥中过量表达兰花DSCKX1基因, 导致内源细胞分裂素的含量显著下降, 从而产生了细胞分裂素缺失表型, 如茎生长延迟, 而根的生长加速 (Yang et al., 2003a, 2003b 。过量表达AtCKX1-4基因的拟南芥植株中, 内源细胞分裂素的含量

26、显著下降, 表现多种细胞分裂素缺失表型(Werner et al., 2003, 类似于细胞分裂素受体三突变体的表型(见下述。拟南芥细胞分裂素缺陷的表型之一是促使胚乳细胞分裂与生长, 因而CKX基因过量表达导致转基因种子的明显增大(Werner et al., 2003, 暗示细胞分裂素对提高农作物产量的潜在价值。这一重要推测最近在水稻中得到证实。在水稻中, 许多重要农艺性状都是受数量遗传性状(QTL基因控制的。日本和中国科学家通过图位克隆鉴定分析了其中的一个主要QTL基因GN1A, 发现其编码一个细胞分裂素氧化酶(OsCKX2。通过对不同产量性状的栽培品种Koshihikari(低产、 Ha

27、bataki、5030、5150和90B2(后3个品种在我国长江流域大规模48223(5种植等的分析发现, 高产品种(后4个品种中OsCKX2基因均携带不同的功能缺失性突变, 促使体内细胞分裂素含量增加, 特别是在分生组织与生殖器官中增加更为显著, 因而导致小穗数和小穗中籽粒数显著增加(Ashikari et al., 2005。这一发现对新一轮绿色革命具有重大意义。细胞分裂素在体内的修饰、相互转换与转运对调控其生理活性具有重要意义(Mok and Mok, 2001。细胞分裂素可以在自由态、核苷和核苷酸等形式之间相互转换。这种转换不仅影响了细胞分裂素的动态平衡而且还影响了其转运, 因而受到广

28、泛关注。植物体中细胞分裂素的种类繁多, 形式最简单的是自由态的异戊烯基腺嘌呤(isopentenyladenine, iP和反式玉米素(trans-zeatin, t-Z, 而更多的是发生在N3、N7和N9基团上的、以iP 和t-Z 通过N-糖基化、N-丙酰基化或O-糖基化、O-乙酰基化等形式存在的结合态细胞分裂素。一般认为,结合态细胞分裂素是储藏形式(糖基化等或转运形式(核苷化, 而自由态为主要的生物学活性形式。因此, 不同形式细胞分裂素的转换被认为是调节其体内平衡的主要方式之一 (Mok and Mok, 2001。在糖基化修饰中, 了解最清楚的例证之一是玉米素配糖物(zeatin O-g

29、lucoside。玉米素配糖物的形成是由玉米素O-葡萄糖基转移酶(zeatin O-glucosyltransferase, ZOGT催化的 (Dixon et al., 1989; Veach et al., 2003。糖基化形式的细胞分裂素不但影响了细胞分裂素的活性, 而且这种形式的细胞分裂素不能被细胞分裂素氧化酶降解。然而, 这种糖基化是可逆的,葡萄糖苷酶可以切割糖苷键释放出自由态的细胞分裂素 (Brzobohaty et al., 1993。一般认为,细胞分裂素的结合态形式较为稳定, 但在有关酶的作用下, 非结合态与结合态细胞分裂素之间可以互变, 植物可以在一定程度上以形成不同程度结合

30、态的方式来调节植物体内细胞分裂素的水平。虽然, 人们对细胞分裂素的O-糖基化的了解较多, 但对N-糖基化的认识仍有限。Hou等(2004 分析了105个重组糖基转移酶对细胞分裂素的催化活性, 从中鉴定出2个细胞分裂素N-糖基转移酶(CK N-glucosyltransferase, CKNGTUGT76C1和UGT76C2, 分别催化N7和N9位细胞分裂素的糖基化。体内实验表明UGT76C1能使外源施加的细胞分裂素发生糖基化。与O-糖基化不同, 细胞分裂素7-N-糖苷和9-N-糖苷不能被糖苷酶所识别, 因而该反应是不可逆反应(图1。细胞分裂素的N-糖基化可能参与了植物体内的解毒反应(Letha

31、m and Palni, 1983。1.3 细胞分裂素的转运在所有植物激素中, 对生长素的极性运输及其对植物生长发育的调控作用的了解比较系统, 而对其它所有激素的转运了解甚少。近年来, 对细胞分裂素转运的研究获得部分线索。由于细胞分裂素只能在特定的组织和细胞合成,因此必须通过扩散或主动运输的方式运输到靶位细胞才能正确行使功能。目前已有的证据表明两类蛋白可能参与了细胞分裂素的运输, 即嘌呤透性酶(purine permeases, PUPs和核苷转运蛋白。利用酵母细胞进行的生化研究表明,这两种蛋白都能转运自由态和核苷形式的细胞分裂素。拟南芥中有2个嘌呤及其衍生物的转运蛋白AtPUP1和AtPUP

32、2, 二者均能在酵母细胞中转运自由态细胞分裂素, 但其在植物体内的功能未知 (Gillissen et al., 2000; Burkle et al., 2003。目前认为在植物体内, 细胞分裂素主要以核苷的形式运输 (Mok and Mok, 2001; Sakakibara, 2006。通过筛选拟南芥pga22/ atipt8的抑制子突变体, Sun等(2005鉴定了一个弱抑制子突变soi33 (suppressor of ipt8。分子遗传学研究发现SOI33基因编码一个扩散性核苷转运蛋白AtENT8。生理学和生化研究表明SOI33/AtENT8以及其同源蛋白AtENT3参与了拟南芥体

33、内核苷结合态细胞分裂素的转运。在特定条件下, soi33和atent3突变体对外源结合态细胞分裂素的反应减弱, 但对自由态外源激483 2006邓岩等: 细胞分裂素:代谢、信号转导、交叉反应与农艺性状改良素的反应没有明显变化。外源核苷类细胞分裂素吸收的测定结果表明, soi33和atent3对结合态3H-iPR的吸收比野生型降低了40%, 然而对3H-tZR的吸收没有明显地变化(Sun et al., 2005。上述结果表明SOI33/AtENT8和AtENT3可能是结合态细胞分裂素iPR的主要转运蛋白之一。对水稻中同源蛋白的生化研究印证了这一结论。在酵母细胞中异源表达的水稻OsENT2蛋白能

34、够高亲和力地转运iPR, 而对t-ZR的转运效率很低 (Hirose et al., 2005。ENT 家族蛋白功能的初步确定是继生长素转运蛋白PIN家族蛋白功能分析后发现的第二类植物激素转运蛋白。目前还不确定ENT家族蛋白参与的细胞分裂素的转运是否为植物体内细胞分裂素转运的主要形式。2细胞分裂素的信号转导途径近年来的研究表明, 在植物体内细胞分裂素是利用了一种类似于细菌中双元组分系统的途径将信号传递至下游元件的。在拟南芥中,首先是作为细胞分裂素受体的组氨酸激酶(Arabidopsis histidine kinases, AHKs与细胞分裂素结合后自磷酸化, 并将磷酸基团由激酶区的组氨酸转移

35、至信号接收区的天冬氨酸; 天冬氨酸上的磷酸基团被传递到胞质中的磷酸转运蛋白(Arabidopsis histidine-phosphotransfer proteins, AHPs, 磷酸化的AHPs进入细胞核并将磷酸基团转移到A型和B型反应调节因子(Arabidopsis response regulators, ARRs上, 进而调节下游的细胞分裂素反应。B型ARR是一类转录因子, 作为细胞分裂素的正调控因子起作用, 可激活A型ARR基因的转录。A型ARR 作为细胞分裂素的负调控因子可以抑制B型ARR的活性, 从而形成了一个负反馈循环(图2。最近的一项研究发现, 细胞分裂素受体CRE1/A

36、HK4/WOL除激酶活性外还同时具有磷酸酶的活性, 可以将磷酸基团从磷酸化的AHPs 上转移回CRE1的天冬氨酸上, 说明细胞分裂素介导的磷酸基团传递是一个双向的可逆的过程(Mahonen et al., 2006a (图2。在拟南芥中发现了3个作为细胞分裂素受体的AHK、5个AHP以及23个ARR。分子生物学和遗传学研究表明, 不同的AHK、AHP 和ARR之间在序列上有着很高的同源性, 并存在高度的功能冗余现象。最近的研究发现它们同时也具有一定的功能特异性,不同的AHK、AHP和ARR可能在特定的细胞分裂素反应或与其它信号途径的交叉反应中起主要作用。这些功能冗余又不失特异性的蛋白一起组成了

37、细胞分裂素的信号转导网络(图2。关于细胞分裂素信号转导的双元组分系统,已经有很多综述对其进行了系统全面的介绍和讨论 (Hwang et al., 2002; 郑丙莲等, 2003; Kakimoto, 2003b; Ferreira and Kieber, 2005。下面将着重讨论关于AHKs、AHPs和ARRs功能的一些最新研究进展以及细胞分裂素与其它信号途径之间的交叉反应。2.1 组氨酸激酶AHK在拟南芥中, 目前发现有3个组氨酸激酶是细胞分裂素的受体, 分别为AHK2、AHK3和CYTOKININ R ESPONSE 1(CRE1(又名AHK4和WOODEN LEG, WOL。其中, 最

38、先发现的CRE1是因为其功能缺失型突变体的外植体在含有适当浓度的细胞分裂素和生长素时不能形成绿色愈伤和不定芽而被分离鉴定到的(Inoue et al., 2001。CRE1蛋白以依赖于细胞分裂素的方式特异地互补酵母和大肠杆菌相关组氨酸激酶缺失突变体的表型(Inoue et al., 2001; Suzuki et al., 2001。此外, 表达CRE1的酵母细胞膜提取物具有与细胞分裂素特异的高亲和力(Yamada et al., 2001, 因此, CRE1是一个细胞分裂素受体。在原生质体的瞬时表达系统中, 过量表达CRE1导致细胞分裂素标记基因(marker gene对细胞分裂素超敏感(H

39、wang and Sheen, 2001, 而在幼苗中, 细胞分裂素对根伸长的抑制作用在cre1突变体中明显减弱, 说明CRE1作48423(5图2 细胞分裂素信号转导模式图位于质膜上的受体AHK2、3和4在结合细胞分裂素后, 其激酶区中保守的组氨酸发生自磷酸化, 之后磷酸基团转移至其信号接收区中保守的天冬氨酸, 进而传递至胞质中的AHP1-5上将其激活。磷酸化的AHP进入细胞核后将磷酸基团传递至核内的A型和B型ARR上, 以激活下游的细胞分裂素反应。其中, AHK4/CRE1受体不仅具有激酶活性, 也具有磷酸酶活性, 可以将磷酸基团从磷酸化的AHP转移到自身的天冬氨酸上。B型ARR的信号接收

40、区可以抑制自身的活性, 而细胞分裂素启始的磷酸传递可以解除这种抑制作用, 进而激活A型ARR等细胞分裂素初级反应基因的表达。而A型ARR又可以反过来抑制B 型ARR的活性。B型ARR也可以激活CRF的表达, 而细胞分裂素又可以通过AHK及AHP诱导CRF进入细胞核与B型ARR一起共同调节部分细胞分裂素初级反应基因的表达。AHP6作为细胞分裂素的负调控因子, 可以抑制磷酸基团由AHP1-5到B型ARR的传递, 其自身的表达又受到细胞分裂素的抑制(AHP6的定位及细胞分裂素抑制其表达的机制仍不清楚。此外, CKI1和CKI2可能通过受未知信号的激活而参与细胞分裂素信号转导。Fig. 2 A mod

41、el of the cytokinin signaling pathwayUpon binding by cytokinin, the cytokinin receptors AHK2, 3 and 4 are autophosphorylated at the conserved His residues in the kinase domain. The phosphoryl group is then transferred to the conserved Asp residues located in the receiver domain of the receptors, fol

42、lowed by transferring to the His residues of AHP1-5 in the cytoplasm. The phosphorylated AHPs are subsequently translocated into the nuclei, and transfer the phosphoryl group to the A-type ARR and B-type ARR proteins, leading to the activation of the downstream components. Note that, the AHK4/CRE1 r

43、eceptor has both kinase and phosphatase activities, which can transfer a phosphoryl group from an AHP to the Asp residue of the receptor. The receiver domain of the B-type ARR proteins negatively regulate their own activities, whereas cytokinin-activated phosphorelay relieves the repressive effect,

44、resulting in the expression of cytokinin primary responsive genes (e.g., A-type ARRs. A-type ARRs, in turn, negatively regulate B-type ARRs by an unknown mechanism. Whereas the B-type ARRs can also activate the CRF expression, cytokinin induces nuclear-localization of CRFs in an AHK- and AHP-depende

45、nt manner. Together with B-type ARRs, CRFs regulate the expression of cytokinin primary responsive gene. AHP6 is a negative regulator of the cytokinin response by inhibiting the transfer of phosphoryl groups from AHP1-5 to B-type ARRs. Expression of AHP is repressed by cytokinin by an unknown mechan

46、ism (subcellular localization of AHP6 is unclear. CKI1 and CKI2, activated by unknown stimuli, may also be involved in the cytokinin signaling.485 2006邓岩等: 细胞分裂素:代谢、信号转导、交叉反应与农艺性状改良为细胞分裂素受体在细胞分裂素信号转导中起正调控作用。AHK2和AHK3也被陆续证明能在体外和体内特异地结合细胞分裂素(Yamada et al., 2001。3个受体的胞外区均具有保守的CHASE结构域, 被认为是细胞分裂素的结合区(An

47、antharaman and Aravind, 2001; Pas et al., 2004。细胞分裂素3个受体基因的大多数单突变体和双突变体对外源激素的敏感性有不同程度的降低, 但在正常生长条件下均无明显的生长发育缺陷,表明其功能的冗余性。对a h k2/ ahk3、ahk2/cre1和ahk3/cre1双突变体的研究发现, 双突变体与各自的单突变体相比对细胞分裂素的敏感性均有进一步的降低。虽然外源细胞分裂素对根伸长的抑制作用在cre1突变体中明显减弱, 但ahk2和ahk3单突变体以及ahk2/ahk3双突变体的反应与野生型没有明显区别, 表明细胞分裂素在根中的作用可能主要是通过CRE1行

48、使的(Higuchi et al., 2004; Nishimura et al., 2004。相反, 虽然ahk2/ahk3双突变体表现出地上部分生长缺陷(包括叶子变小和茎变短等, 但ahk2/cre1和ahk3/cre1双突变体均没有明显的发育异常, 说明细胞分裂素在植物地上部分的作用可能主要是通过AHK2和AHK3行使的(Higuchi et al., 2004; Nishimura et al., 2004。ahk2/ahk3/cre1三突变体对外源细胞分裂素的反应几乎被完全阻断, 同时其植株生长迟缓,根、叶生长发育严重受阻, 育性也受到了严重的影响 (Higuchi et al.,

49、2004; Nishimura et al., 2004。上述结果说明细胞分裂素在植物生长发育中起着重要的作用, 而功能冗余的AHK2、AHK3和CRE1在细胞分裂素信号转导途径上起正调控的作用, 但其功能具有一定的特异性(见下述。细胞分裂素的主要生理功能之一是延缓叶片衰老 (Mok and Mok, 2001。衰老与光信号也密切相关。通常, 离体叶片在黑暗中会加速衰老。在筛选可以延缓黑暗诱导的离体叶片衰老的突变体时, Kim等(2006分离鉴定了一个AHK3的功能获得型突变体。进一步研究发现,过量表达AHK3的转基因植物同样可以延缓黑暗诱导的离体叶衰老, 而AHK3的功能缺失型突变体则会加速

50、离体叶的衰老, 同时细胞分裂素对叶片衰老的抑制作用在ahk3突变体中也出现了大幅的减弱(Kim et al., 2006, 说明AHK3在细胞分裂素调节的叶片衰老过程中起到了正调控作用。AHK3在调控衰老中的作用表现出高度的特异性: 与ahk3突变体不同, 细胞分裂素对ahk2和cre1突变体的叶片衰老的抑制作用没有受到明显的影响 (Kim et al., 2006, 表明在细胞分裂素调节叶片衰老的过程中, AHK3起到了主要的调控作用。在研究细胞分裂素受体作用的分子与生化机理方面, 最近也取得了突破性进展。如前述,大部分ahk4的等位突变体(包括功能完全缺失的突变体在正常生长条件下没有明显的

51、生长发育缺陷, 但其中的2个等位突变wooden leg (wol 和wol-2却出现了严重的根维管组织的发育缺陷(Mahonen et al., 2000; de Leon et al., 2004,其表型与ahk2/ahk3/ahk4三突变体的表型类似(Higuchi et al., 2004; Nishimura et al., 2004。由于任意一个或任意组合的受体双突变体没有明显的根发育缺陷, 因此wol和wol-2突变可能抑制所有3个受体启动的信号转导。有趣的是在wol/wol-2杂交的F1代中, wol-2可以互补wol 根的发育缺陷, 但不能互补wol对细胞分裂素敏感性减弱的表

52、型(de Leon et al., 2004, 即表现为部分的等位间互补(i n t e r-a l l e l i c complementation。此外, 在筛选wol的抑制突变体中分离鉴定的16个突变体中有13个是WOL基因本身的突变, 即WOL基因中的另一个突变抑制或互补了wol的表型(Mahonen et al., 2006a,即等位内互补(i n t r a-a l l e l i c complementation。上述遗传学研究表明CRE1/AHK4/WOL本身可能具有负反馈或自调控的机制。进一步的生化实验表明, 细胞分裂48623(5素存在时, CRE1表现出自磷酸化的激酶

53、活性, 并将磷酸基团由ATP转移至不同的AHP上。而在没有细胞分裂素时, CRE1表现出磷酸酶活性,将磷酸基团从不同的AHP上转移回CRE1上的天冬氨酸 (Mahonen et al., 2006a。因此, CRE1是一个双功能的酶, 它不仅具有组氨酸激酶活性, 也具有可以将AHP去磷酸化的磷酸酶活性,说明细胞分裂素介导的磷酸基团传递是双向的可逆的过程 (Mahonen et al., 2006a。根据这一模型, 不难解释在wol突变中观察的等位内和等位间互补现象。wol突变发生在细胞分裂素结合的胞外区, 使其不能与细胞分裂素结合。因此, 无论细胞分裂素存在与否, WOL突变蛋白始终维持在磷酸

54、酶活性状态, 从而阻断了磷酸基团向下游的传递(包括AHK2和AHK3启动的信号转导, 导致严重的发育缺陷(Mahonen et al., 2006a。如果WOL突变蛋白的功能丧失(例如类似wol突变的抑制子突变中的情况, 则解除了其负调控或组成型的磷酸酶活性状态, 从而恢复正常的细胞分裂素信号转导。值得指出的是, AHK2和AHK3均表现出磷酸激酶的活性,但不具备可检测到的磷酸酶活性 (Mahonen et al., 2006a, 这进一步表明功能高度冗余的3个受体在功能及作用机制等方面存在着一定的特异性。除上述3个细胞分裂素受体外, 2个组氨酸激酶CYTOKININ INDEPENDENT1

55、 (CKI1和CKI2可能也参与了细胞分裂素信号转导的调控。CKI1编码一个具有跨膜结构的组氨酸激酶, 但其胞外区不具备保守的CHASE结构域。此外, 在体外实验中CKI1不能与细胞分裂素结合, 因此, 一般认为CKI1可能不是细胞分裂素受体。cki1-D功能获得性突变体表现出典型的细胞分裂素表型(Kakimoto, 1996, 其功能缺失型突变体表现为雌配子不育表型(Pischke et al., 2002; Hejatko et al., 2003。但在胚胎发育以及之后的生长发育过程中, cki1功能缺失型突变体在生长发育以及对外源激素的反应性上均无明显表型(邓岩和左建儒, 待发表。CKI

56、2编码的组氨酸激酶不含有跨膜区, 其功能缺失型突变体在正常生长条件下也没有明显的表型(Mizuno, 2005。关于CKI1和CKI2的作用机制仍有待进一步研究。2.2 磷酸转运蛋白AHP在拟南芥中存在着5个AHP基因(AHP1到AHP5, 它们编码了一类约150个氨基酸的蛋白,并含有保守的组氨酸磷酸转移结构域。因为可以互补酵母的组氨酸磷酸转运蛋白突变体的表型(Wurgler-Murphy and Saito, 1997; Suzuki et al., 1998, 且在体外实验中可以从大肠杆菌的膜提取物和CRE1(或AHK2, AHK3, CKI1, CKI2上接收磷酸基团并转移至ARR上(I

57、mamura et al., 1999; Mahonen et al., 2006a, AHPs被确定为有功能的组氨酸磷酸转运蛋白。AHPs本身的表达不受细胞分裂素诱导。在原生质体瞬时表达系统中, 细胞分裂素处理导致AHPs由胞质转移至细胞核内, 推测AHPs将磷酸基团由膜上的受体最终转移至细胞核内的ARRs上(Hwang and Sheen, 2001。通过酵母双杂交分析及体外检测AHKs激酶活性的研究, 发现不同的AHP和不同的AHK以及ARR之间存在着广泛的互作(Imamura et al., 1999。由于功能的冗余性, AHPs与细胞分裂素的联系一直缺乏遗传学的证据。虽然过量表达AH

58、P2使转基因植物的根和下胚轴对细胞分裂素的敏感性略为上升 (Suzuki et al., 2002, 但在外植体中, 过量表达AHP1、AHP2和AHP5均不能促进细胞分裂素对标记基因ARR6的诱导(Yamada et al., 2001。此外, ahp单突变体对外源细胞分裂素的敏感性也没有明显的改变。但最近的研究发现, ahp1,2,3三突变体对外源细胞分裂素敏感性降低, ahp1,2,3,4,5五突变体不仅表现出了对细胞分裂素的不敏感性而且伴有严重的发育缺陷 (Ferreira and Kieber, 2005; Mizuno, 2005, 从而证明了AHPs是一类功能高度冗余的、在细胞分

59、裂素信号转导途径中起487 2006邓岩等: 细胞分裂素:代谢、信号转导、交叉反应与农艺性状改良正调控作用的因子。除AHP1-AHP5外, 在拟南芥基因组中还发现了一个高度同源的基因AHP6/APHP1。在AHP1-AHP5中高度保守的组氨酸在AHP6中变成了天冬酰胺, 因而AHP6可能不具备磷酸转运蛋白的功能。在酵母及体外实验中发现, AHP6的确不具备磷酸转运蛋白的活性, 相反却抑制磷酸基团从AHP1到ARR1的传递, 并可能同时抑制磷酸基团从AHKs的组氨酸到天冬氨酸的传递。事实上, ahp6的缺失突变体是在筛选wol表型的抑制子突变体中获得的, 即ahp6可部分抑制wol表型。此外, ahp6对外源细胞分裂素敏感性明显增强, 而外源细胞分裂素可以抑制AHP6的表达(Mahonen et al., 2006b。因此, 生化和遗传学的证据都表明AHP6可能是细胞分裂素信号转导的负调节因子。2.3 反应调节因子ARR拟南芥基因组中共发现