药学分子生物学

1、第一章 基因与基因组基因（gene）:是指合成有功能的蛋白质、多肽或RNA所需的全部 DNA序列（除部分病毒RNA） ，是基因组的一个功能单位。基因组（genome） ： 是指生物体一套完整的单倍体遗传信息的总和，包括所有基因和基因间的区域。基因组的主要功能是贮存和表达遗传信息，是物种及其个体之间区别和联系的最本质生物学特征。基因组学（genomics ） ： 是研究生物基因组的结构、功能及表达调控的一门科学。调控序列（顺式作用元件）：一个基因的调控区和其结构基因位于同一个DN册子的相邻部位，这种调节方式称为顺式调节，相应的DNA列成为顺式作用元件。（1）启动子：RNA聚合酶特异性识别和结合的

2、DNA序列。（2）增强子：能强化转录起始的一段DN附列。（3）沉默子（4）终止子。反式作用因子：通过识别或结合顺式作用元件上的核心序列从而参与调控基因转录的蛋白 质。也称转录因子。原核生物基因组结构特点:1. 具有类核结构2. 以操纵子为功能单位/ 多顺反子mRNA3. 结构基因大多为单拷贝，编码序列一般不重叠4. 结构基因大多没有内含子5. 非编码序列比例约为一半6. 含可移动DNA 序列操纵子（operon ）操纵子是原核生物的一段DN际列，由几个串联排列的功能相关的结构基因，加上调节序列组成的一个完整的连续的功能单位。操纵子结构通常与启动子区域有部分重叠，可通过代谢物与调节蛋白相互作用而

3、激活或抑制基因转录，这是原核生物最常见的转录调节方式。真核生物基因组结构特点1. 基因组庞大，为线状双链DNA2. 断裂基因3. 非编码区与单顺反子4. 大量重复序列5. 基因家族与假基因断裂基因（split gene ） : 真核生物结构基因由外显子与内含子间隔排列，内含子在转录后被剪切掉。基因家族（multi gene family ） ： 是来源相同，结构相似，功能相关的一组基因，由某一共同祖先基因经重复和突变产生。假基因（pseudogene） ： 与具正常功能基因序列相似，但无转录功能或其转录产物无功能的 基因。人类基因组计划（HGP）HGP勺主要目标：? 遗传图谱：基因或? 物理图

4、谱：一级结构上两个? 序列图谱：基因组? 转录图谱：正常或受控条件全基因表达的时空图。HGP勺意义：基因或 DN雨记在染色体的相对位置与遗传距离。一级结构上两个 DN端段之间的实际距离。基因组 DNA勺全部核甘酸序列。正常或受控条件全基因表达的时空图。? 鉴定人类全部基因，推动生物技术发展。? 理解疾病与基因的关系。? 推动模式生物研究。? 促进多学科发展与交叉融合。 不同生物基因组结构特点：病毒原核生物真核生物基因组较小，只含一种核具有类核结构、通常一条环基因组庞大，为多条线状双链 DNA酸（DN RNA状双链DNA分子（基因组、（细胞核、细胞器 DNA质粒DNA含有重叠基因以操纵子为功能单

5、位（多顺断裂基因反子mRNA存在转录单元结构基因大多为单拷贝，编非编码区远多于编码区码序列一般不重叠单顺反子噬菌体基因连续，感染真结构基因大多没有内含子、存在大量重复序列核细胞的病毒基因不连续是连续的编码序列占绝大部分非编码序列比例约为一半基因家族与假基因主要为单拷贝序列（反转含可移动DNA序列（转座 DNAC端具有端粒结构录病毒含有两个拷贝）子）蛋白质组（proteome）： 一个细胞、一个组织或者一个有机体的基因组表达的所有蛋白质。蛋白质组学（proteomics ）：阐明生物体各种生物基因组在细胞中表达的全部蛋白质的表达 模式及功能模式的学科。第二章PCR、核酸杂交、基因芯片PC矶本原理

6、：以待扩增的DNA为模板，以一对分别与模板互补的寡核甘酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，以 dNTP为底物，按照半保留复制的原理，通过变性、退火、延伸三个 步骤完成新的DNA合成，并反复重复这一过程。PC或应步骤：高温变性：94 c获单链模板低温退火：55 c引物结合单链模板适温延伸：72 c DNA新链合成PC或应体系：DNA模板、引物（决定 PC或应特异性）、耐热DNA聚合酶、dNTR缓冲体 系一、二价阳离子PCRM DNAM制的比较：相同点：DN蛤成反应DN咪合酶参与需要引物4种dNTP为原料不同点：体外反应仅合成特定DNA片段（由1对引物限定）变温条件下进行仅一种耐热的DNA聚合酶参

7、与DNMI 物循环多次PC或应体系的优化： 特异性、有效性、忠实性1、DNA聚合酶：耐高温、保真性、激活剂2、模板DNA种类、用量、质量3、dNTP:浓度一致、稳定4、DNA弓|物：决定PCRT增产物的特异性和长度。引物设计一般遵循的原则：长度；碱基随机分布；避免引物间、引物自身互补；引物的3'端不能修饰、不应错配；两条引物之间退火温度不大于5 oC。PC破术的应用1） 基因克隆2） 基因检测（1） PCR 产物的限制性片段长度多态性分析（ PCR-RFLP）基因突变会导致基因序列中产生新的限制性核酸内切酶位点或使原有限制性核酸内切酶位点消失。因此， 突变基因经相应的限制性核酸内切酶水

8、解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变，根据这些改变可以判断突变是否存在，即限制性片段长度多态性技术。（2） PCR 产物的单链构象多态性分析（PCR-SSCP）基于单链DNA勾象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA由于碱基组成或排列顺序不同，形成不同的构象。利用PCR扩增目的基因片段，通过变性成为单链，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳，单个核甘酸的改变会造成单链DNA片段构象的改变，其迁移率随之改变，从而检测基因的突变。（3） PCR 产物的等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（PCR-ASO）采用PCRT增受检者基因的目标片段，并与相应的ASO探针杂交。针对已知突变位点的基因，设计一

9、对寡核苷酸探针，其中一条为野生型探针（N） ， 与正常序列互补，另一个为突变型探针（M） ，突变碱基应位于探针的中央，与突变序列互补。PCR行生技术（一）巢式PCR（二）逆转录PCR （RT-PCR）先将RNA用反转录酶反转录成 cDNA然后再加入特异引物对目标片段进行扩增，扩增产物 的分析与普通PCR类似。反转录酶：AMV MoML收转录酶反转录引物：随机引物、Oligo （dT） 、特异性引物用途：检测基因表达水平；检测RNAW毒（三）多重PCR在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的DNA段的方法。优点：多个致病基因同时检测。（四）定量PCR实时荧光定量PCR在PC或应体系中加入反应

10、PCRT增进程的荧光染料或荧光标记探针，实时监测PCR±程中荧光信号的变化，通过参照基因或标准曲线对起始模板DNA勺浓度进行精确定量分析。实时荧光定量PCR原理如何对起始模板定量？通过 Ct 值和标准曲线对起始模板进行定量分析三个基本概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct 值扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle ） ；纵坐标：荧光强度荧光染料：SYBR Green I核酸分子杂交原理： 核酸变性与复性核酸分子杂交技术用标记的已知序列的核酸片段（探针）来检测样品中未知核酸序列（形成异源杂交体），再经显影或显色的方法，将结合的核酸的位置或大小显示出来。核酸探针（probe ）能与待测的靶核

11、酸序列特异性互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核酸片段。核酸探针类型DN琳针： 基因组DN琳针；cDNA探针； 寡核甘酸探针RN琳针核酸探针标记物放射性标记物：32P, 3H ,35S灵敏度高；但存在环境污染和半衰期短等缺点。非放射性标记物：生物素、光敏生物素、地高辛、酶、荧光素等，但灵敏度和特异 性较放射性标记物差。核酸分子杂交技术应用固相杂交迹杂交 （blotting hybridization） : Southern blot 、Northern blot斑点杂交（dot hybridization）原位杂交（in situ hybridization）液相杂交印迹杂交的一

12、般步骤：1 .样品制备和电泳分离2 .样品变性处理、转印3 .探针制备和标记4 .预杂交与杂交5 .洗去未杂交的游离探针6 .检测杂交信号7 .结果判断与分析印迹技术（blotting ）将核酸或蛋白质等生物大分子通过一定方式转移并固定到固相支持物上以便进一步分析的 方法。1. Southern blot （DNA检测）通过核酸内切酶降解样品中DNA再经凝胶电泳分离，将分离后的DNA段从凝胶转移到吸附薄膜上并固定，随后用标记的探针进行杂交，以检测目的 DNA步骤：1.DNA片段分离变性2.DNA片段转移与固定3.杂交反应4.杂交信号检测2. Northern blot（RNA 测）RNA经变性

13、凝胶电泳分离后，转移固定到固相支持物上，与标记的探针杂交并检测。（分析基因的转录和 mRNA子的大小）。3. Western blot（蛋白检测）基本原理：通过电泳11而同的蛋白组分，并转移至固相支持物，通过特异性抗体作为探针，对靶蛋白（抗原）进行检测。也称为免疫印迹（ immunoblotting ）。主要用途：1.鉴定蛋白质表达情况2.比较不同样本中特定蛋白质相对表达量3.分析蛋白-蛋白间相互作用（蛋白质组学研究）三种印迹技术的共同点基本步骤相同（电泳、转印、杂交反应、杂交信号检测）三种印迹技术的不同点Southern BlotNorthern BlotWestern Blot检测对象DN

14、ARNA蛋白质疑胶种类琼脂糖琼脂糖聚丙烯酰胺预处理（变性剂）限制性酶切NaOH甲醛热变性SDS险测探针DNAcDNA抗体原位杂交：在保持细胞形态的条件下，检测与探针互补的核酸序列在细胞内的空间位置。荧光原位杂交采用荧光标记的探针与待测样本中的核酸进行原位杂交，从而检测核酸序列在组织或细胞中的定性、定位及相对定量。遗传性疾病的产前诊断荧光原位杂交筛选 21三体（间期）FISH检测白血病细胞 BCR-AB同合基因荧光原位杂交检测上皮细胞中人乳头瘤病毒的感染基因芯片（gene chip）? 将大量探针有序排列于固相支持物表面或直接在固相支持物上原位合成探针，然后 与标记的待测核酸样品进行杂交，通过对

15、探针分子杂交信号强度的分析来获知样品 中相应分子的数量和序列信息。? 由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为基因芯片。蛋白质芯片? 高通量的蛋白质功能分析技术，用于分析蛋白质表达谱，研究蛋白质间或蛋白质与 其他分子间相互作用，筛选药物作用蛋白靶点。? 基本原理：将各种蛋白质有序地固定于载体上成为检测用的芯片，然后用标记的蛋 白质或其他成分与芯片作用，洗去未结合的成分，再利用扫描技术测定芯片上各点 的荧光强度，来分析蛋白质间或蛋白质与其他分子之间的相互作用关系。三、基因克隆、表达和调控基因克隆五个基本部分：一、目的DNA勺分离获取（分）；二、载体的选择与限制酶切（切）；三、目的DNAf载体

16、连接（连）；四、重组DNA专入受体细胞（转）；五、重组体的筛选与鉴定（筛）。（一）目的基因的获得化学合成基因组文库与 cDNAC库：包含全面的基因和mRNA言息基因组文库（genomic library , G-文库）是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。cDNA 文库（cDNA library , C-文库）以细胞全部mRNAg逆转录，制备出全套的cDNA克隆集合。利用PCR RT-PCR扩增技术合成序列已知的基因其它技术（二）目的基因与表达载体的重组载体（vector ）：携带外源DNA®入宿主细胞进行扩增或表达的工具。按功能分：克隆载体；表达载体多克隆位点（MCS

17、： 一段人工合成的 DNA序列，含有密集排列的多种限制性内切酶识别序列， 以便不同来源的外源 DNA片段插入载体。1 .限制性核酸内切酶识别双链DNA分子中特异核甘酸序列的一类核酸内切酶，为原核生物所特有。分类：I、n、出类基因工程技术中常用的是n类（分子剪刀），识别位点与切割位点序列特异，且在识别序列内切割2 . DNA 连接酶（基因工程的“缝纫针”）一种封闭DNAB1上缺口的酶，催化 DNA链相邻的3'羟基与5'磷酸基团生成磷酸二酯键。3 、目的基因与载体重组及其策略（一）粘性末端连接缺点：载体自身环化；双向插入；碱性磷酸酶（ALP）催化去除DNA RNAe dNTP上的5

18、'-磷酸基团。主要用途有：防止载体 DNA自身环化，提高重组效率。（二） 定向克隆：使目的基因按正确方向插入载体中的方法。定向克隆的两种连接方式：粘-粘连接：粘-平 连接（三）人工接头（linker）化学合成的含一种或多种限制酶切位点的平端双链寡核甘酸片段。本法适用于在载体和目的基因上没有相同的限制酶切位点（四）同聚物加尾连接本法适用于在载体和目的基因上没有相同的限制酶切位点（五）PCR引入粘性末端后连接可在PCRT增目的基因时将限制性酶切作用位点人为添加到引物的5'末端。以目的基因为模板，经PCRF增获得带有引物序列的目的基因，用相应的限制性核酸内切酶切割后，产生粘性末端，随

19、后与载体（也经相应的限制性核酸内切酶切割）进行粘性末端连接。基因克隆中常用的工具酶1-限制性核酸内切酶一一用于切割DNM段2、DNA连接酶一一用于催化 DNA片段连接3-碱性磷酸酶一一去除核酸分子末端的磷酸基团4-末端转移酶一一介导 DNAC端加尾，产生限制酶切作用位点5、DNA聚合酶常用于 PCRT增DNA6-逆转录酶一一以 RNA为模板合成cDNA转化：将重组质粒导入受体细胞转染或称为转导：将噬菌体重组子或病毒重组子导入受体细胞质粒：是在细菌内除染色体之外的能自主复制到的共价闭合环状双链DNA随着细菌分裂能够稳定地把自己的遗传特性传递给子细胞。重组体的筛选和鉴定阳性克隆：含有目的基因的宿主

20、细胞克隆。筛选出含有重组 DNA（目的基因+载体）的克隆阳性克隆的筛选方法（一）针对载体携带的筛选标记根据遗传表型进行筛选抗生素抗性筛选遗传标记补救筛选噬菌斑筛选（二）针对重组体结构和表达产物筛选基因工程技术的应用：1 .制备基因组文库、cDNA文库、核酸探针、基因工程药物、疫苗及抗体2 .制造转基因动植物（改良生物性状）3 .基因诊断、基因治疗基因工程生产胰岛素药物流程：1,目的基因的获取：通过各种手段（基因组文库，化学合成，PCR技术等）获取胰岛素基因。2,基因表达载体的构建：用限制酶切割质粒和目的基因（胰岛素基因）使产生不同的粘性 末端，再用DNA连接酶使质粒和胰岛素基因连接形成重组质粒

21、。3,将重组质粒导入受体细胞（如大肠杆菌，用感受态细胞法即CaCl2转化法），筛选阳性重组体。4,将含有胰岛素基因的阳性重组体在宿主细胞内进行诱导表达、检测、并纯化表达产物。RNAT扰：在生物体细胞内，双链RNA子诱导同源mRNA寺异性降解，导致基因表达抑制， 又称转录后基因沉默。RNAT扰作用机制（1） siRNA 形成：dsRNA Dicer 酶剪切成 siRNA（2） RISC （RNA-induced silencing plex） 形成（3） RISC活化：siRNA解旋成为单链，无活性的 RISC转变成活性形式（包含siRNA反义 链）（4）诱导靶 mRNA条解：在siRNA反义链

22、引导下，RISC识别并切割与 siRNA反义链互补的 靶 mRNA（5） dsRNA的再生成细胞中存在两种 RNA干扰现象：siRNA （小干扰RNA）： 21-23nt ,由长dsRN顺解而成的小片段，可诱导mRNA条解。siRNA 主要参与抵御外源性病毒核酸的侵染。miRNA （微小RNA）： 42 22nt ,由miRNA前体剪切而成，可抑制 mRN腐译。miRNA主要 参与内源性基因的表达调节。siRNA（小干扰RNA）miRNA（微小RNA）siRNA是外源性的，是RN奸扰的中间产物miRNA是内源的是生物体固有结构siRNA是双链RNAmiRNA链 RNADicer 酶.加工过程对

23、称地来源于双链 RNA不对称加工，仅剪切 miRNA的侧臂作用彳4gsiRNA可作用于mRNA勺任何部位miRNA主要作用于靶标基因 3 '端非翻译区（3' -UTR）作用方式siRNA 一般导致靶 mRNA勺降解，即 ,转录水平后调控。miRNA可抑制靶mRNA勺翻译，也可以导 致靶mRNA条解，即在转录后水平和翻 译水平起作用作用阶段siRNA不参与生物生长， 要作用是抑制病毒感染miRNA主要在发育过程中起作用，调节 内源基因表达RNAT扰技术的应用基因治疗（基因失活性治疗）（1）病毒感染性疾病：通过 RNAi抑制RNA病毒的复制（2）基因过表达引起的疾病（如肿瘤）：si

24、RNA药物基因功能研究（功能失活策略） 基因失活性治疗： 将特定的反义核酸（反义 RNA反义DNA、核酶、siRNA、miRNA等导入细胞，在转录和翻 译水平阻断某些基因的异常表达。基因失活性治疗面临的问题：1.药物的稳定性2.药物的安全性3.药物的转运载体基因靶向：利用同源重组原理对生物细胞特定的内源基因进行改造的技术。插入到基因组中，从而DNA片段替代，从而使靶以提高药物的疗效及安全基因敲入：外源功能基因与宿主基因组中的同源序列进行同源重组, 在细胞内获得表达。基因敲除：宿主基因组中特定功能靶基因的部分片段被同源的外源基因失活第七章药物基因组学药物基因组学：是研究遗传变异与药物反应相互关系

25、的一门学科， 性为目标。单核甘酸多态性（SNP）:在基因组水平上由单个核甘酸的变异所引起的DN际列多态性。SNP是RFLP STR之后的第三代遗传标记。SNP寺点：1.最常见可遗传变异；2.数量多分布广；3.具有遗传稳定性；4.具有二态性, 易于自动化规模化分析；5.可直接影响基因功能SNP佥测技术：1. PCR技术；2.核酸杂交技术；3.生物芯片技术；4. DNA测序技术。单体型：位于一条染色体特定区域的一组相互关联，并倾向于以整体遗传给后代的单核甘酸多态组合。遗传变异与药物应答（一）基因多态性与药物代谢（二）基因多态性与药物转运（三）基因多态性与药物效应靶分子基因分型指导临床用药随着药物基因组学研究对多种基因多态性与药物应答关系的逐渐阐明，随着各种基因检测和基因分型技术的快