氧反常心肌细胞内游离钙浓度的变化及丹参素和SOD的影响

1、    氧反常心肌细胞内游离钙浓度的变化 及丹参素和SOD的影响        摘要目的：观察心肌细胞氧反常时细胞内的游离钙浓度的变化，探讨丹参素和SOD对细胞内的游离钙浓度的影响。方法： 体外分离成年大鼠心肌细胞复制氧反常模型，缺氧40 min后给氧20 min，用钙荧光探针（Fluo-3）分别测定了正常大鼠心肌细胞(Control,n=11)、缺氧40min(H40 min,n=11)以及缺氧40 min再给氧20 min(H40 min R 20min,n=1

2、2)的大鼠心肌细胞内的游离钙浓度，并观察了丹参素(H40minR20min+DS,n=10)和SOD(H40minR20min+SOD,n=11)对氧反常的心肌细胞内的游离钙浓度的影响，并用显微镜观察了细胞杆形率的改变。结果：氧反常组的细胞内的游离钙浓度（596.71±20.29 nmol/L）明显比正常对照和单纯缺氧40 min的高（158.67±5.01和328.51±13.86 nmol/L，P0.01）。加入丹参素和SOD，可明显降低氧反常细胞内的游离钙的浓度（分别为254.29±8.83和300.04±13.04 nmol/L，P0.

3、01）。细胞杆形率亦有类似的改变。结论：氧反常时心肌细胞发生明显的钙超载，丹参素和SOD对细胞内钙超载具有一定的防治作用。主题词心肌；氧；钙；丹参；超氧化物歧化酶 Effects of Salvia Miltiorrhizae and SOD on Ca2+-overloadedrat myocardial cells in oxygen paradoxZHU Fu-Xiang,LIU Guo-Mei,YANG Zhi-Hong,WANG Xiao-Ming,MA Li-Ying Institute of Radiation Medicine,Beijing(100850)AbstractAI

4、M:To observe the changes of intracellular free calcium concentration in oxygen-paradoxed rat myocardial cells and to discuss the protective effects of Salvia Miltiorrhizae (DS) and SOD on Ca2+-overloaded rat myocardial cells.METHODS: Adult rat myocardial cells was isolated in vitro and oxygen parado

5、x model was made.Selecting 40 min as hypoxia period followed by 20 min of reoxygenation,a new calcium fluoresence probe (Fluo-3) was used to detect the intracellular free calcium concentration in control (n=11)、H40min (hypoxia,n =11) and H40minR20min (hypoxia+reperfusion,n=12) groups respectively.We

6、 also looked into the rod-shaped rates of myocardial cells with microscope.In addition,the effect of Salvia Miltiorrhizae (n=10) and SOD (n=11) on intracellular free calcium concentration and rod-shaped rate of oxygen-paradoxed myocardial cells were observed.RESULTS: The intracellular free calcium c

7、oncentration of H40minR20min group increased far beyond the control and H40min groups (596.71±20.29 nmol/L vs 158.67±5.01 and 328.51±13.86 nmol/L,P0.01),showing a significant Ca2+-overload.The changes of rod-shaped rates were similar to intracellular free calcium concentration.Salvia

8、Miltiorrhizae and SOD can inhibit Ca2+-overload obviously (254.29±8.83 and 300.04±13.04 nmol/L vs H40minR20min 596.71±20.29 nmol/L,P0.01).Moreover,effect of Salvia Miltiorrhizae was more striking than SOD (P0.01).CONCLUSION:There is a significant Ca2+-overload in oxygen-paradoxed myoc

9、ardial cells.Salvia miltiorrhizae and SOD have a definite protective effect on Ca2+-overload.MeSHMyocardium; Oxygen; Calcium; Salvia Miltiorrhizae; Superoxide dismutase自70年代初Jenning发现“心肌缺血再灌注损伤”与心肌细胞钙浓度大量增加可能有关以来，大量的研究都支持这一观点。目前认为“钙超载”是再灌注损伤的一个主要因素，细胞内钙超载是心肌缺血再灌注损伤的重要病理改变之一，被认为是细胞死亡的最后共同通路1。从这个理论出发，

10、研究再灌注损伤时细胞内游离钙的改变并探讨如何防止钙超载，对于进一步阐明再灌注损伤的机理和保护再灌注损伤的心肌都具有重要的实际意义。本文用体外分离的大鼠心肌细胞复制氧反常模型以模拟再灌注损伤，用钙荧光探针（Fluo-3）测定细胞内游离钙浓度的改变，并观察丹参素和SOD对氧反常的心肌细胞内游离钙浓度的影响。材料与方法(一) 材料：1灌流液成份与浓度：A液（mmol/L）：NaCl 143.0,KCl 8.0,MgCl2 5.0,CaCl2 1.8,Glucose 5.0,NaH2PO4 0.42,HEPES 5.0,pH 7.4；B液：不含CaCl2，其他同A液；C液：B液加0.1%胶原酶和50.

11、0 mmol/L CaCl2；D液（mmol/L）：NaCl 118.0,KCl 30.0,MgCl2 0.5,KH2PO4 10.0,Glucose 10.0,谷氨酸 70.0，EGTA 0.5,BSA 2%,HEPES 10.0,pH 7.4；E液：D液中加10.0 mmol/L CaCl2。2试剂：I型胶原酶（Sigma公司）；A23187（NAKARAI chemical Ltd）；Fluo-3/AM（Dojin，KYOTO JAPAN）；HEPES（分析纯，华美公司）；丹参素（上海第一医科大学药理教研室制备）；SOD（哈医大生化教研室研制，系纯化的小牛红细胞Cu-Zn-SOD；其它试

12、剂均为国产分析纯。3仪器：荧光分光光度计（RF-540型，日本岛津公司）；显微镜（Olympus公司）。(二) 大鼠心肌细胞的分离与实验分组：健康雄性Wistar大鼠，体重200250 g。按Farmer的方法2加以改进，体外分离心肌细胞，具体操作如下：按45 mg/kg腹腔注射0.6%戊巴比妥钠麻醉动物，同时注射0.2%肝素20 mg/kg抗凝，开胸，距主动脉根部34 mm剪断主动脉取出心脏，迅速移至非循环无作功的Langendorff灌流装置。用95%O2 5%CO2混合气体饱和的A液灌注15 min（灌流压为90 cmH2O）后，旋即用B液灌注5 min，使心脏停搏；用C液通过电子蠕动泵

13、恒流循环灌注1 h，最后用D液非循环灌注5 min；剪下心室肌于适量的D液中，用眼科剪充分剪碎并反复吹打以分散心肌细胞，尼龙网滤过后，上清用D液洗3次，离心收集心肌细胞，悬浮于E液，调节细胞浓度为6×105/2mL。实验分组如下：（1）正常对照组（持续通以95%O2 5%CO2，37°C温育40 min，n=11）；（2）缺氧40 min组（H40 min，持续通以95%N2 5%CO2，37°C温育40 min，n=11）；（3）氧反常组（H40 min R20 min， 缺氧40 min后给氧20 min，n=12）；（4）丹参素保护组（H40 min R20

14、 min+DS，氧反常+丹参素，终浓度为40 mg/L，n=10）；（5） SOD保护组（H40 min R20 min+SOD，氧反常+SOD，终浓度为3.7×105 IU/L，n=11）。(三) 细胞内游离钙的测定：用钙荧光探针Fluo-3/AM，测定方法按文献4进行。(四) 细胞杆形率的计算：各组细胞取1滴用0.4%胎盘蓝染色，光镜下计数200个细胞，计算拒染的杆形细胞所占的比率。(五) 统计处理：实验数据均以±s表示，组间差异显著性用t检验判定。结果(一) 心肌细胞分离结果：本实验所分离的心肌细胞胎盘蓝染色杆形率达94.00%±2.50%。(二) 细胞内游

15、离钙浓度的变化：正常心肌细胞内游离钙浓度为(158.67±5.01) nmol/L,缺氧处理后游离钙浓度明显升高，P0.01；再给氧（氧反常）后，游离钙浓度更行升高，与单纯缺氧组相比，P0.01；加丹参素和SOD处理，游离钙浓度与氧反常组相比，明显回落，P0.01，而且丹参素的效果更明显，与SOD比，P0.01。结果如表1。表1 丹参素和SOD对细胞内游离钙浓度的影响Tab 1 Effect of DS and SOD on intracellular free Ca2+ concentration (±s)GroupnCa2+i (nmol/L)ControlH40min

16、H40minR20minH40minR20min+DSH40minR20min+SOD1111121011158.67±5.01328.51±13.86*596.71±20.29*254.29±8.83#300.04±13.04#*P0.01,vscontrol；*P0.01,vs H40min；# P0.01,vs H40minR20min，()P0.01,vs H40minR20min+SODH=hypoxia; R=reperfusion (三) 细胞杆形率的改变：缺氧组的心肌细胞的杆形率明显低于正常对照组（94.14%±3.2

17、5%，P0.01）；氧反常组的的杆形率更低，与缺氧组比，P0.01；丹参素组和SOD组的杆形率明显高于氧反常组，P0.01，而以丹参素组更明显，与SOD组相比，P0.01。结果见表2。表2丹参素和SOD对心肌细胞杆形的影响Tab 2Effect of DS and SOD on rod-shaped rate ofcardiomyocytes(±s)GroupnRod-shaped rate (%)ControlH40minH40minR20minH40minR20min+DSH40minR20min+SOD111112101194.14±3.2548.30±1.

18、93*26.31±3.32*64.25±3.17#51.60±2.10#*P0.01,vs control;* P0.01,vs H40min；# P0.01,vs H40minR20min; ()P0.01,vs H40minR20min +SOD 讨论钙离子参与人体许多细胞正常生理活动，包括细胞增殖、信息传递、心肌兴奋-收缩耦联、神经冲动的传导、细胞分泌、形态发生以及细胞老化等诸多方面。所有这些功能的发挥都有赖于钙离子在细胞内外相差10 000倍的分布，而这种分布是能量依赖性的。心肌再灌注损伤是一种重要的病理生理现象，其发生与这种钙离子细胞内外正常分布的破坏亦

19、即细胞内钙超载有密切的关系。我们实验室曾用焦锑酸钾作为钙离子的指示剂证明再灌注损伤的心肌细胞内有大量的钙盐沉着,尤以缺血40min再灌最为明显3。通过细胞内游离钙的测定亦得到类似的结果（另文报道）。如何防止钙超载从而保护再灌注心肌的功能，除了尽早进行再灌注或预处置（preconditioning）以增加心肌对缺血再灌注损伤的耐受性以外，需要采用适当的保护剂，这也是缺血再灌注损伤研究的重要课题之一。本文用体外分离的大鼠心肌细胞氧反常模型，以缺氧40 min为再给氧的时间点，观察了细胞内游离钙的变化，并对比观察了丹参素和SOD对钙超载的防治作用。结果显示，缺氧40min再给氧20 min时细胞内游

20、离钙浓度比单纯缺氧40 min显著为高，伴有明显的钙超载现象，细胞杆形率的变化亦然。丹参素和SOD可显著降低氧反常时细胞内游离钙，提高细胞杆形率，表现出对氧反常心肌细胞的保护作用，而且前者的作用优于后者。关于钙超载的发生机理，目前认为主要与Na+/Ca2+交换增加4、再灌时产生的大量的氧自由基对膜结构的破坏作用5以及儿茶酚胺的作用6有关。最近的研究表明7，心肌细胞局部的肾素-血管紧张素系统亦参与了钙超载的发生。丹参是一种具有活血化淤作用的中草药，我们以前的工作表明它可通过打破氧自由基介导的恶性循环性细胞损害的发病连锁环，抑制脂质过氧化物的形成从而抑制钙离子的大量内流，达到保护心肌从而避免再灌注

21、损伤的作用8。丹参素还能对线粒体膜电位和ATP酶合成反应有明显的恢复与保护作用9。另有研究表明10，丹参对急性缺血后再灌注心肌PIP2和IP3的高水平状态有明显的抑制作用，提示丹参防治再灌注损伤的机制可能与其抑制心肌组织磷脂肌醇系统的代谢，使肌浆网内钙离子释放受抑，从而减轻心肌细胞内钙超载的程度有关。SOD防止钙超载的机制在于其对再灌注过程中大量产生的氧自由基具有灭活作用，防止膜脂质过氧化，维持膜结构与功能的完整性。本文结果显示丹参素的作用优于SOD，这为开发和利用丹参这种具有丰富资源的中草药的药用价值提供了依据。作者单位：朱甫祥:北京市放射医学研究所 (北京 100850)刘国美：安徽省宣州

22、市人民医院杨志宏：山东省烟台市烟台山医院内科王孝铭马丽英：哈尔滨医科大学病理生理教研室参考文献1Nalyer WG,Panagiotopoulos S,Elz JS,et al.Calcium-mediated damage during post-ischemic reperfusion.J Mol Cell Cardiol,1988， 20(suppl.II):41.2Farmer BB,Mancina M,Williams ES,et al.Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts.Life Sci,1983， 33:1.3李芳，王孝铭，李相忠.缺血/再灌注时心肌细胞内Ca2+分布的时相性改变及丹参的影响.中国病理生理杂志