氧化型胆固醇对血管平滑肌细胞的损伤作用

1、    氧化型胆固醇对血管平滑肌细胞的损伤作用        【摘要】目的以胆固醇为对照，观察3-5-6-三羟胆固烷（cholestane-3,5,6-triol）、25-羟胆固醇（25-hydroxycholesterol）、7-酮胆固醇（7-ketocholesterol）及环氧胆固醇（cholesterol-5,6-epoxide）四种氧化型胆固醇对大鼠主动脉平滑肌细胞的损伤作用。方法取610代细胞，测定细胞存活率、细胞培养液乳酸脱氢酶活力，用电子自旋共振自旋标记检测膜

2、脂流动性和膜蛋白构象。结果氧化型胆固醇呈时间和剂量依赖性降低细胞存活率、增加培养液乳酸脱氢酶活力，以3-5-6-三羟胆固烷损伤最重。氧化型胆固醇还使膜脂流动性降低、膜蛋白构象改变及运动减慢。胆固醇除改变膜脂流动性外,在相同剂量及相同作用时间的情况下,对细胞无损伤作用。结论氧化型胆固醇对血管平滑肌细胞有损伤作用，其中以3-5-6-三羟胆固烷损伤最重，胆固醇对细胞没有损伤作用。氧化型胆固醇的细胞损伤与膜物理性质改变有关。【关键词】肌,平滑细胞胆固醇 Cytotoxic effect of oxysterols on culturedrat aortic smooth muscle cellsFEN

3、G ZhihuiZHONG ChongxiaGE Shujunet alDepartment of Biophysics, Beijing Medical University, Beijing 100083【Abstract】ObjectiveThe cytotoxic effects of four oxysterols (cholestane-3,5,6-triol,25-hydrocholesterol, 7-ketocholesterol, cholesterol-5,6-epoxide) on cultured rat aortic smooth muscle cells were

4、 compared with that of cholesterol. MethodsWith the cells in passages between 6 and 10，cell viability was detected by trypan blue test. Lactate dehydrogenase (LDH) leakage was detected by LDH kit. Using electron spin resonance spin labelling, cell membrane lipid fluidity, membrane protein conformati

5、on were measured. Results Exposed to oxysterols, cell viability decreased and LDH leakage increased in a dose- and time-dependent manner. After being injured by oxysterols membrane lipid fluidity reduced and membrane protein conformation changed significantly. Cholesterol in the same dosage and at t

6、he same experiment period as oxysterols showed no cytotoxic effect. Conclusion (1) Oxysterols are cytotoxic to cultured smooth muscle cell. (2) Of these four oxysterols, cholestane-3,5,6-triol is the most potent. (3)Cholesterol shows no cytotoxicity, except change of membrane lipid fluidity. (4) Oxy

7、sterol-induced cell injury might be associated with change in physical properties of membrane.【Key words】muscle, smoothcellscholesterol氧化型胆固醇（cholesterol oxides,oxysterols,Ch-Ox）是一族胆固醇（cholesterol,Chol）的氧化衍生物，包括羟胆固醇、酮胆固醇及环氧胆固醇三大类。早在1966年就发现动脉粥样化组织内有Ch-Ox的存在1，但由于人们一直认为高胆固醇血症是动脉粥样硬化症（AS）的危险因素之一，因此多年来把

8、注意力集中在Chol上。虽然对Ch-Ox有过少量报道，但并未引起重视。近年来，随着对低密度脂蛋白（LDL）的研究深入，认识到氧化修饰的LDL(ox-LDL)和带负电性LDL(LDL-)中含有大量的Ch-Ox2。甚至有学者认为它们的毒性主要来自Ch-Ox2,3,4-6。因此唤起了人们对Ch-Ox的注意，但国人涉足该领域者甚少。由于Ch-Ox结构与Chol相似，且均为脂溶性物质，可插入细胞膜，本实验选出几种在高胆固醇血症的血浆和动脉壁，以及动脉粥样化组织中常见的Ch-Ox，与Chol平行地观察它们对平滑肌细胞的损伤作用。材料与方法1.试剂:培养液1640、胰蛋白酶购自GIBCO公司。3-5-6-三

9、羟胆固烷（chlestane-3,5,6-triol,3-triol）、25-羟胆固醇（25-hydroxycholesterol,25-OH）、7-酮胆固醇（7-ketocholesterol,7-Keto）、环氧胆固醇（cholesterol-5,6-epoxide,CE）、胆固醇（cholesterol,Chol）、5或16-氮氧自由基硬脂酸（5或16-doxylstearic acid,5NS或16NS）、马来酰亚胺（maleimide,MSL）购自Sigma公司，其余试剂均为国产分析纯。2.大鼠胸主动脉平滑肌细胞（SMC）原代培养:取Wistar大鼠（体重约250g，北京医科大学动物

10、实验部提供）。将动物胸主动脉的中膜组织以组织贴块法进行SMC原代培养。经肌动蛋白抗体免疫组化法鉴定后，证实为SMC。实验用610代细胞。3.实验分组:实验分正常对照、Chol对照和Ch-Ox实验组。Ch-Ox组又分为3-triol、25-OH、7-Keto及CE组。细胞取自同批原代培养的SMC。4.细胞损伤的指标测定:(1)细胞存活率测定：用苔盼蓝排斥法。(2)培养液乳酸脱氢酶（LDH）活力的测定：将SMC按常规胰蛋白酶消化收集，按105个/ml细胞接种到培养板。胆固醇作用后，收集培养液，用7150型全自动生化分析仪测定各组培养液中LDH活力（LDH试剂盒法）。(3)膜脂流动性及膜蛋白构象检测

11、7：将三种自旋标记物5NS、16NS和MSL溶解后分别加到损伤组（3-triol 50mmol/L、7-Keto 50mmol/L）及两个对照组的细胞悬液中，使终浓度为1×10-4mol/L。37孵育。5NS及16NS标记30min，MSL标记3h。然后用0.1mol/L磷酸盐缓冲液洗数次。检测最后1次冲洗液上清无自旋标记信号时，将已标记的SMC吸入石英管中，用varian E-109型电子自旋共振（ESR）仪测量。微波功率5mV，调制100kHz、调制幅度10-4T、扫宽100×10-4T、扫场时间3min、温度293K。5统计学处理:实验数据均以均数±标准差表

12、示，组间差异比较采用t检验。结果1.Ch-Ox对SMC细胞存活率的影响:几种Ch-Ox作用SMC 24h后，细胞存活率下降，呈剂量依赖性。在同一浓度下，3-triol的毒性最甚，其次为25-OH、7-Keto，CE最弱。各种Ch-Ox在不同浓度下，与相应Chol对比，3-triol、25-OH、7-Keto分别在25、50、75mmol/L使存活率下降30.49%(P<0.001)、17.58%(P<0.001)、27.65%(P<0.001)；CE仅有下降趋势,而纯胆固醇对存活率无影响（1）。3-triol 25mmol/L、7-Keto 75mmol/L使SMC存活率呈时

13、间依赖性降低。与相应Chol 125mmol/L比较，3-triol在6h使存活率降低8.33%(P<0.05)；7-Keto仅有下降趋势。Chol 125mmol/L作用48h对存活率没有影响（2）。1氧化型胆固醇对SMC细胞存活率影响的浓度曲线(注：n=5，每个点为5个样本的均值；2、3、4同此)2氧化型胆固醇对SMC细胞存活率影响的时间曲线2.Ch-Ox对SMC培养液LDH活力的影响:几种Ch-Ox作用SMC 24h后，培养液LDH活力随Ch-Ox浓度增加而增加，损伤呈剂量依赖性。在同一浓度下，3-triol的损伤明显为重，其次为25-OH、7-Keto，CE最弱。各种Ch-Ox在

14、不同浓度下，与相应Chol比较，3-triol、25-OH、7-Keto分别在25、50、75mmol/L使培养液LDH活力增加385.71%(P<0.001)、395.65%(P<0.001)、179.4%(P<0.001)；CE仅有增加趋势；而纯胆固醇对培养液LDH活力无影响（3）。3-triol 25mmol/L、7-Keto 75mmol/L使培养液LDH活力呈时间依赖性增加。与相应Chol 125mmol/L比较，3-triol在12h使培养液LDH活力增加211.11%(P<0.05)；7-Keto仅有增加趋势。Chol作用48h对培养液LDH活力没有影响（

15、4）。3氧化型胆固醇对SMC培养液LDH活力影响的浓度曲线4氧化型胆固醇对SMC培养液LDH活力影响的时间曲线3.Ch-Ox对SMC膜脂流动性、膜蛋白构象的影响:将5NS、16NS插入SMC膜脂，得到ESR谱。通过对波谱参数测算7，得序参数S（表1）。S代表氮氧自由基附近脂质分子的有序性，S值增大，说明膜脂有序性增高，流动性降低；反之，膜脂流动性升高。从表1可知，SMC膜脂表层的流动性小于疏水的终末甲基区。与正常组比较，3-triol、7-Keto作用12h后，SMC膜表层及深层S值均增大（分别为P<0.01与P<0.05），即膜脂该二微区的流动性均明显下降。Chol亦使深层流动性

16、下降（P<0.05）。若与Chol对照组相比，3-triol、7-Keto（5NS标记组）对S值影响差异有显著性（P<0.05），表明Ch-Ox与Chol对SMC膜脂影响有区别。表15NS,16NS标记平滑肌细胞的S值(±s)组别n5NS16NS对照组50.460±0.0200.188±0.002Chol组50.469±0.0180.198±0.005*3-triol组50.501±0.005*0.206±0.003*?7-Keto组50.497±0.009*0.199±0.005*注：与正常

17、组比较，*P<0.05,*P<0.01;与Chol对照组比较，P<0.05 MSL标记SMC后，得到ESR谱。通过对波谱参数测算7，得到强、弱固定化比值S/W和蛋白旋转相关时间c(表2)。S/W是膜蛋白运动自由度较小的强固定成份与运动自由度较大的弱固定成份之比。c系蛋白由一种构象转变为另一种构象所需的时间。3-triol作用12h后，使S/W及c值增大（P<0.01），说明膜蛋白弱固定化成份减少，膜蛋白构象改变及运动速度降低。7-Keto及Chol对膜蛋白的构象及运动速度无显著影响。与Chol相比，3-triol使c明显增加(P<0.05)。表2MSL标记平滑肌细

18、胞的S/W及c值(±s)组别nS/Wc/10-8s对照组50.318±0.0771.214±0.102Chol组50.494±0.2141.338±0.2383-triol组50.691±0.069*1.798±0.199*7-Keto组50.443±0.1921.242±0.478注：与正常组比较，*P<0.01;与Chol对照组比较，P<0.05 讨论自1966年Brooks等1首次报道在人动脉粥样硬化组织检测到Ch-Ox（26-羟胆固醇与7-Keto）后，揭开了人们在研究Ch-Ox与AS

19、关系的历史。近年来开始形成热点。目前已知，在正常人和动物的血浆及动脉壁含有低浓度的Ch-Ox。有报道，在人血浆中总Ch-Ox量为22mmol/L，兔血浆为6mmol/L5。高胆固醇血症时，兔血浆中总Ch-Ox含量高达150mmol/L。高胆固醇血症的血浆及动脉壁，以及动脉粥样斑块中常见的Ch-Ox有：7或7-羟胆固醇、7-Keto、26-羟胆固醇以及3-triol等1-3,5-8。随着对ox-LDL及LDL-致AS性质研究的深入，发现它们中含有大量的Ch-Ox，主要是7-位置Ch-Ox，包括7或7-羟胆固醇，另外还有胆固醇-7-氢过氧化物，后者可再形成7或7-羟胆固醇2,3,7。因此认为Ch-

20、Ox在AS的发生和演变中具有不可忽视的作用。我们以Chol为对照，观察了3triol、25-OH、7-Keto及CE对大鼠SMC作用。结果表明，Ch-Ox呈时间和剂量依赖性降低细胞存活率和增加培养液LDH活力，提示Ch-Ox增加SMC膜通透性，其中以3-triol损伤作用最重。进一步用ESR自旋标记测定膜脂流动性，膜蛋白构象及运动，揭示Ch-Ox使SMC膜脂流动性明显降低，膜蛋白构象改变、运动减慢。说明Ch-Ox改变膜物理性质，损伤膜脂膜蛋白。从3-triol损伤膜的结果可见，膜脂深层、浅层流动性改变与培养液LDH活力呈明显正相关。相关系数分别为16NS=0.878、5NS0.890。Ch-O

21、x对细胞毒性作用机制还不清楚。主要有两种假说：一种是Ch-Ox下调Chol合成的限速酶3-羟-3-甲基戌二酸单酰CoA还原酶，抑制Chol合成，Chol是生物膜的基本组成成份，它的缺乏必然导致膜功能紊乱9。另一种假说是Ch-Ox嵌入生物膜，影响膜脂流动性、膜功能和稳定性8,10。至于第一种机制已有报道，结论为Ch-Ox细胞毒性与抑制Chol合成能力不一致11,12，这说明该机制不能完全解释Ch-Ox细胞毒性。本实验揭示Ch-Ox对膜脂流动性、膜蛋白的构象确有影响，而且还揭示3-triol引起膜脂流动性改变与培养液LDH活力呈正相关。说明Ch-Ox的细胞毒性作用与其嵌入膜后引起膜物理性质改变有关

22、。因此，本实验结果支持第二种假说。一个值得注意的问题是Chol也能嵌入膜，也同样会改变膜的物理性质，较长时间作用后，会影响电压敏感钙通道及多种ATP酶活性13，最终导致细胞内Ca2+超载。在本实验条件下，Ch-Ox与Chol平行给予，在1224h Ch-Ox便诱发明显的细胞损伤。而Chol除降低膜脂流动性外，即使剂量比Ch-Ox高5倍的情况下，对SMC未显毒性作用。Ch-Ox的极性强于Chol，在水相中的扩散也强于Chol，因此嵌入膜的能力要逊于Chol。但是，一旦嵌入膜内，从本实验结果可见其对膜脂流动性及膜蛋白构象的影响较胆固醇大。总之，Ch-Ox的毒性作用需进一步探讨。基金项目：本课题为国

23、家自然科学基金资助项目（编号：39470344）作者单位：100083北京医科大学生物物理系参考文献1Brooks CJW, Harland WA , Steel G. Squalene, 26-hydroxycholesterol and 7-ketocholesterol in human atheromatous plaques. Biochem Biophys Acta, 1966, 125: 620-622.2Salonen JT, Nyyssonen K, salonen R, et al. Lipoprotein oxidation and progression of caro

24、tid atherosclerosis. Circulation, 1997,95: 840-845.3Sevanian A, Hodis HN, Hwang J, et al. Characterization of endothelial cell injury by cholesterol oxidation products found in oxidized LDL. J Lipid Res, 1995, 36: 1971-1986. 4Sevanian A, Seraglia R, Traldi P, et al. Analysis of plasma cholesterol ox

25、idation products using gas- and high- performance liquid-chromatography/mass spectrometry. Free Rad Biol Med, 1994, 17: 397-409.5Chang YH, Abdalla DSP, Sevanian A. Characterization of cholesterol oxidation products formed by oxidative modification of low density lipoprotein. Free Rad Biol Med, 1997,

26、 23: 202-214.6Brow A, Dean RT, Jessup W. Free and esterified oxysterol: formation during copper-oxidation of low density lipoprotein and uptake by macrophages. J Lipid Res,1996, 37: 320-335.7葛淑君，程时. 锌7-与镉7-金属硫蛋白对羟自由基损伤大鼠红细胞膜保护作用的比较. 生物化学杂志, 1997,13: 91-94. 8Guyto JR， Klemp KF. Development of lipid-rich core in human atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1996, 16:4-11.9Tamasawa N, Hayakari M, Murakami H, et al. Reduct