啤酒酵母谷胱甘肽的高效抽提方法

1、第29卷第6期2010年11月Vol. 29 No. 6Nov. 2010食品与生物技术学报Journal of Food Science and Biotechnology文章编号：1673-1689 (2010) 06-0895-06啤酒酵母谷胱甘肽的高效抽提方法杨海麟，张玉然，辛瑜，仝艳军，张玲，王武*(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122)摘 要：建立了一种从酿酒酵母干细胞中高效抽提谷胱甘肽(GSH)的新方法，料液比为1 : 8,釆 用醋酸-盐酸调节抽提pH值为35,抽提温度(701) *C的条件下，GSH抽提量可达5. 50 mg/g, 比已报道的其它抽提法提高

2、54.49%62.24%。抽提液经微滤(膜孔径0. 45.0. 22 Mm).超滤(膜 截留相对分子质量5 000)处理，蛋白质总去除率为60.98%。所得超滤液经高效液相法和氨基酸 分析仪分析表明，粗提物中的杂质除蛋白质、小肽外，氨杀酸类杂质主要为谷氨酸，为GSH的进一 步精制提供了基础数据。关键词：酿酒酵母；谷胱甘肽(GSH)；抽提；微滤；超滤；分析中图分类号:TS 201.2文献标识码：AAn Efficient Method for Glutathione Extraction fromDried Saccharomyces CellsYANG Hai-lin, ZHANG Yu-ra

3、n, XIN Yu, TONG Yan-jun, ZHANG Ling, WANG WiT (Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education Jiangnan University, Wuxi 214122 China)Abstract： An efficient method for glutathione(GSH) extraction from the dried Sacchromyces cells was proposed in this study. During extraction at (70

4、 1), the mixture of acetic acid hydrochloric acid was used to adjusted pH 3. 5, the ratio of solid to liquid (w/v) was kept at 1 ：8. GSH extraction result reached at 5. 5 mg/g, which was 54. 49% -62. 24% higher than rhar of all of the reported extraction process. After treatment through micro-filtra

5、tion (0. 45.0 22 #m) and ultra-filtration (5 kD MWCO), 60. 98% of the yeast protein was removed. The collection from ultrafiltration was analyzed by high performance liquid chromatography and amino acid analyzer, the result showed that glutamic acid was the major portion in amino acids impurity besi

6、des prot&n and small peptide in crude extract, and these would provide basic data for purifying GSH. Key words: Saccharomyces glutathione ( GSH ) ectraction, micro-filtration t ultra-filtration t analysis谷胱甘肽（GSH）是一种具有重要生理功能的天然活性三肽（L-广谷氨酰半胱氨酰甘氨收稿日期：2009-10-22基金项目：江南大学自主科研计划学科交叉创新团队基金项目（1042050205091

7、140）。作者简介：杨海（1971-）,男，江苏无锡人，工学博士，副教授。主要从事发酵工程研究。Email： 19891996sinan. com关通信作者：王武（1952-）,女，福建福州人，教授，博士生导师，主要从事发酵工程、遗传工程的研究。Email: wangwujiangnaiL第6期杨海麟等：啤酒酵母谷胱甘肽的高效抽提方法899酸），在空气中易氧化为氧化性谷胱甘肽 （GSSG）,具有抗氧化、解毒、改善风味等作用，在临 床医药、食品行业、化妆品行业等领域有着广泛的 用途，近期研究发现GSH还具有抑制艾滋病的 作用旳。目前国内的GSH整体分离纯化技术较为 落后，致使产品质量在纯度、浓度

8、等方面难以不能 满足医药和食品行业的要求，高纯度GSH产品大 多依靠进口。生产出符合食品医药级要求的高纯 度GSH产品亟待解决。GSH的生产方法以发酵 法为主，从发酵液中分离提取GSH的方法主要有 铜盐法、金属螯合亲和色谱法、离子交换树脂分 离法等，其中以离子交换树脂分离法最为有效, 生产成本最低，易于工业化。在GSH的抽提方法中，陈娜等以面包酵母 为原料研究了超声波破碎法，GSH抽提量为3. 975 mg/g,但细胞破壁后胞内蛋白质、色素、核酸等杂质 大量溶出，将对后期的膜过滤和树脂分离带来困 难，且难以工业化应用；林志兴等7】以酿酒酵母为 原料研究了热水抽提法，克服了破壁的缺陷，GSH 抽

9、提得率仅为0. 301%；熊志强等以酿酒酵母为 原料研究了乙醇抽提法，此抽提法蛋白质浸出量更 少,但与热水抽提法所得GSH抽提量差别不大，且 抽提时间较长（60 min）,综上所述，一种高GSH抽 提量、低杂质浸出量的快速节能的抽提方法仍有待 于探讨。为解决上述问题，本实验对抽提啤酒酵母GSH 的方法进行改进，采用醋酸-盐酸调节抽提前pH, 并对相关条件进行优化。发现此改进的方法GSH 抽提量最高可达5. 50 mg/g,与以上抽提方法进行 实验比较，其GSH抽提量比其它方法提高 54.49%62.24%,蛋白浸出量增加不大。抽提液 经微滤、超滤技术处理后，蛋白质总去除率为 60. 98%,并

10、对超滤液成分和稳定性探讨分析，为离 子交换树脂法（得到高纯度GSH最有效节能的方 法）精提纯化GSH提供有利条件和参考。此法 GSH抽提量高、杂质浸出量低、快速节能易操作，可 为工业上综合利用废啤酒酵母提取GSH提供参 考。1 材料与方法1.1实验材料市售安琪啤酒干酵母。1.2主要试剂GSH与GSSG纯品：日本协和公司产品；DT- NB试剂：上海世泽生物科技有限公司产品，SIGMA公司分装；乙睛（色谱纯）:江苏汉邦科技有限公 司生产产品；其它试剂均为化学分析纯。1.3主要仪器Agilent高效液相色谱系统:美国安捷伦公司生 产;安捷伦氨基酸分析仪：美国安捷伦公司生产； 3K15低温高速离心机：

11、德国SIGMA公司产品；超 滤装置：中科院上海应用物理所膜分离技术研究发 展中心研发；微滤杯：天津市津腾实验设备有限公 司生产；UV754紫外可见分光光度计：上海精密科 学仪器有限公司生产。1.4实验方法1. 4.1 GSH抽提法（醋酸-盐酸调节抽提前pH）条 件的优化 各取3 g啤酒干酵母，加入27 ml去离 子水中，其中3组先加冰醋酸调抽提前pH 37,再 加浓盐酸调抽提前pH分别为2. 3、30.3.5,其中2 组加冰醋酸调抽提前pH 4. 0、50,其中一组加浓盐 酸调抽提前pH 35,另取一组不加酸调节抽提前 pH作为对照,84TC下，搅拌加热14 min；各取10 mL去离子水，分

12、别按料液比1 ： 67、1 : 7.1 J : 8、 1 - 10J : 12.5 J : 20.1 : 40加入啤酒干酵母，混 匀，醋酸-盐酸（先加冰醋酸调pH约3. 7,再加浓盐 酸）调节pH为3.5,61FC下，搅拌加热14 min； 各取10 ml去离子水，加入1.25 g啤酒干酵母，混 匀，醋酸-盐酸（先加冰醋酸调pH约37,再加浓盐 酸）调节pH为35,分别在5个不同的温度（50士 1、（60士1）、（70士1）、（801）、（901）、（941） C下，搅拌加热14 min。以上各组加热搅拌后均置 于冰箱中冷却至室温离心（6 000 r/min,12 min）, 测定不同条件下上

13、清液中GSH的浓度。1. 4.2 几种GSH抽提方法的比较 参照文献报 道方法，在各自不同最优化的条件下，把改进的 GSH抽提法与几种报道的GSH抽提方法进行比 较。其中超声波破碎法的输出功率为800 W,间 隔时间/工作时间为2 s/1 s,破壁率为90.9%；乙醇 抽提法中使用的为体积分数25%的乙醇；热水抽 提法9】抽提后菌液用盐酸调pH为3. 00；以上各方 法抽提后的菌液，均置于冰水浴中冷却至室温，离 心（6 000 r/min,12 min）,测定上清液体积，及其中 GSH和蛋白质浓度。1.4.3 抽提液的膜过滤及其趨滤液稳定性在真 空度为0.095 MPa下，取pH 2. 0的5

14、00 mL抽提 样液，分别采用含孔径045 pm和022卩m混合纤 维素酯微孔滤膜的微滤设备进行分级微滤，依次测 定微滤前后样液中GSH和蛋白质含量；取pH 2.0 的300 mL微滤的样液，在膜压差 = （）25 MPa下，采用含截留相对分子质量5 000聚醛砚超滤膜 的超滤设备进行超滤，测定超滤前后样液中GSH 和蛋白质含量，并采用高效液相法(HPLC)和氨基 酸分析仪分别测定超滤液中GSH的纯度及氨基酸 的种类含量；取超滤液各25 mL,浓盐酸分别调节 pH为20、43、60、70,放置于层析柜内(241) C,计时，测定在0、50、90、180 min时超滤样液中 GSH的浓度。1.5

15、测定方法1.5.1 GSH的含量测定(DTNB法)改进的E11- marfs测定方法，试管中共16 mL反应体系，含有 0 8 mL DTNB 溶液(4 mmol/L DTNB,0. 1 mol/L Na2HPO4),-定体积的N a2 HPO4缓冲液(01 mol/ L,pH 6. 98)和样品溶液，漩涡混合器混合后，室温 静置6 min,测定412 nm处样液OD值，根据建立 的标准曲线计算测定样品中GSH的浓度。料液比=壬酵母岛量科故比去离子水体积(mL)GSH抽提量=菌液离心后上清液中GSH质量(mg)干酵母总量(g)蛋白质浸出量=菌液离心后上清液中蛋白质质量干酵母总量(g)GSH 收

16、率() =膜过滤后溶液中GSH质量(mg)v1AA膜过滤前溶液中GSH质量(mg)人1.5.2 GSH的纯度测定 采用高效液相检测法 (HPLC),色谱条件：色谱柱为Agilent C18柱150 mmX4. 6 mm,5 ;流动相为磷酸盐溶液(取磷酸 二氢钾2. 72 g,庚烷磺酸钠1. 21 g,加水溶解，定容 至1 L,磷酸调节pH至2.5)-乙騰(125 : 1)；体积 流量为0.7 mL/min；检测波长220 nmo柱温25 C,进样 10 MLe153 蛋白质含量测定 采用Bradford检测法, 见参考文献1门。1.5.4 氨基酸组成测定 采用氨基酸OPA FMOC柱前衍生化，

17、氨基酸分析仪测定，色谱条件: 色谱柱为 ODS HYPERSIL250 mm X 4. 6 mm, 5 卩m；流速为1.0 mL/min；柱温40 检测波长338 nm,262 nm(Pro,Hypro)o2 结果与讨论2.1 GSH抽提法(醋酸盐酸调节抽提前pH)条件 的优化2.1.1 抽提pH对GSH抽提量的影响 由图1可 知，抽提前pH 35时,GSH抽提量最大，且离心后 抽提液在pH 2.3和30时较为浑浊，杂质较多，在 pH为4.0和5.0时色素相对较深；在抽提前pH 35下，醋酸-盐酸调节比盐酸调节时，GSH抽提量 提高1538%,这可能是由于醋酸及其盐在pH 3. 5 50时具有

18、较好的缓冲能力，使抽提前后菌液pH 较稳定(仅由35升至3.9),而盐酸调节时菌液pH 抽提前后波动较大(由3.5升至54),较低且稳定的 抽提pH有利于GSH的释放，因此选用醋酸-盐酸调 节抽提前pH 35最佳。5.0O3.3.54.05.0盐酸3.5对照64菌液抽提前pH5 0 54.43.注:吐pH 2.350的溶液使用醋酸-盐酸调节；b对照组自然pH值为6. 4图1抽提PH对GSH抽提的影响Fig. 1 Effect of pH on extraction of GSH2.1.2 料液比对GSH抽提量的影响 由图2可 知,GSH抽提量在料液比1 : 40时最大，1 : 8时次 之。前者

19、比后者GSH抽提抽高5.18%,但使用去 离子水的量是后者的5倍，综合生产中减少劳动强 度、节水节能考虑，选择料液比1 : 8时较适宜。6 16 144.3.3.5.1勿料液比图2料液比对GSH抽提的影响Fig. 2 Effect of the ratio of solid to liquid on GSH extraction2.1.3 抽提温度对GSH抽提量的影响 由图3可知，随着温度的升高GSH抽提量先升高再下降, 其中以（70l）-C最大。温度较低可能会使细胞膜 通透性差，GSH没有更好的从膜内释放，温度过高 可能会导GSH的氧化，因此选择701 C为最佳 抽提温度。2. 2几种GSH

20、抽提方法的比较由表1可知，超声波破碎法和改进的抽提法 GSH抽提量最高,分别为6.11和5. 50 mg/g,后者 比前者低9. 98%,但改进的抽提法得到的抽提液蛋 白、色素等杂质含量也远远低于超声波破碎法，对 下一步的离子交换法精提GSH有利；热水抽提法 和乙醇抽提法的蛋白浸出量比改进的抽提法少 10. 36%和1434%,但改进的抽提法GSH抽提量 分别比二者提高54. 49%和62. 24%,且抽提温度 低、料液比相对较大。综合考虑，改进的抽提法（醋 酸-盐酸调节抽提前pH）最佳。为使离子交换法更 好的精提GSH,以下采用膜过滤方法去除离心后抽 提液中的菌体、蛋白等杂质。6.4 r3.

21、2: 1 50 160土 170 180 土 190 1100温度rc图3抽提温度对GSH抽提的影响Fig. 3 Effect of extraction temperature on the GSH extraction总0D&径班毎HSD第6期杨海麟等：啤酒酵母谷胱甘肽的高效抽提方法#第6期杨海麟等：啤酒酵母谷胱甘肽的高效抽提方法#表1几种GSH抽提方法的比较Tab. 1 The Comparison of some types of GSH extractions方法与料液比抽提抽提抽提前GSH抽提质量蛋白浸出量/结果温度厂C时间/ min后茜液pH分数/（mg/g） 368(1) ：7

22、3 76.3 刘振玉.谷胱甘肽的研究与应用J生命的化学，1995, 15(1):19-21.LIU Zhen-yu. Study and application of glutathioneLj. Life Chemistry 1995. 15(1) : 19 21. (in Chinese)4 王辉，冯万祥.含汞树脂分离提纯谷胱甘肽J华东理工大学学报，1996, 22(6):717-721.WANG Hui 9 FENG Wan-xiang. Purification of glutathione by organomercurial resinJ. Journal of East Chin

23、a University of Science and Technologyt 1996. 22(6) ：717 721. (in Chinese)5 Maki H, Fukuda H. The separation of glutathione and glutamic acid using a simulated moving-bed absorber systemJ Fermentation Technology, 1987, 65(1) ：61 70.6 陈娜，乔长晟，胡玉霞，等.面包酵母中谷胱甘肽抽提方法的研究J.现代食品科技，2008,24(2):157-160.CHEN Nat QIAO Chang-shengt HU Yu-xia et al. Methods for extracting GSH from Saccharomyces Cerevisiae J. Modern Food Science and Technology 2008, 24(2) ：157 160. (in Chinese)7 林志兴，吕永琴，丁轲，等.从酿酒酵母中分离纯化谷胱甘肽J生物加工过程，2007, 5(04) ：60-64