瘢痕成纤维细胞的钙网蛋白表达研究

1、瘢痕成纤维细胞的钙网蛋白表达研究目的 观察钙蛋白(CRT)在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达情况。方法 采用免疫细胞化学染色和原位ELISA技术对体外培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细 胞进行CRT分布定位及表达水平研究。结果瘢痕和正常皮肤成纤维细胞在处于 增殖生长状态时，胞浆及核内均有不同程度的CRT表达，其中瘢痕成纤维细胞表 达CRT水平(A: ± ,ELISA492nm)明显高于正常皮肤成纤维细胞水平(A: ±),差异 有非常显著意义(P<);而在已融合的瘢痕和正常皮肤成纤维细胞内则均无CRTCRT的丰富表达对促进细胞迁移、信号传递及钙表达。结论 瘢痕成纤维细胞内 存

2、储等方面均有着积极作用。Study on the exp ressi on derived fibroblastsof calreticuli nin hypertrop hic scar-Abstract 】Objective To investigate distributio ntheexp ressi onof calreticuli n(CRT) infibroblasts(HSF)a ndno rmal skin-derivedlevel andin tracellulahypertrop hic scar-derive fibroblasts(NSF).Method in HSF

3、 and NSFUsing anti-CRT antibody,CRT was detectedby immuno cytochemistry and ELISA CRT was p rese ntin thecytoplasmand nucleiin proliferating HSF or NSFbut HSF possessed significantly higherexpressionCRT than NSF(P<).in culture, level ofntracellularWhen these cells (HSFnor intranu clearand NSF,the

4、 s abundantdistributi onofand NSF) were fused ,staining for CRT wasCRT is widespread. Because of itn eitheriIn HSFexp ressi on p rotein tering,in tegri n-mediatedultif un cti onalin HSF, we postulatethat CRT as a mp lays an imp orta ntsig nalli ngandrole inCa2+ sequescell adhesi on.【Key words!Hypert

5、rophicionscar FibroblastCalreticulinExp ressscar,HS)作为创伤及外科手术后常见且十分棘手的皮肤组织疾病，瘢痕组织内成纤维细胞异常活化和细胞外间质过度沉积增生性瘢痕(Hypertrophic既是HS的重要组织学特征，也是 HS发生、发展的物质基础。钙蛋白（Calreticuli n,CRT最早是作为一种存在于非肌细胞内质上的主要钙结合蛋白得以认识的1,近几年的研究发现：除具有钙离子储藏作用外，CRT在参与并调节众多细胞生物学活性功能上有着积极影响2-5:,同时它还作为自身抗原在某些免疫性疾病的发病机制中有着极其重要的价值6。我们通过CRT抗体并利

6、用原位ELISA及免疫细胞化学染色技术检测瘢痕成纤维细胞体外表达CRT水平,辅以正常皮肤成纤维细胞作对照，探讨CRT在瘢痕成纤维细胞发挥异常生物学活 性功能中的作用。1材料与方法组织标本增生性瘢痕及正常皮肤组织标本均取自住院病人，年龄1740岁。患者在取标本前无长时间外用各种防治增生性瘢痕药物史，不伴肿瘤及其他严重疾患； 瘢痕组织生长时间均在69个月之间。主要试剂及物品准备羊抗CRT抗体：Michalak博士惠赠。辣根过氧化物酶标记兔抗羊lgG（Zymed 公司）。DABS OPD（Sigma公司）。细胞培养基：DME添力卩10%、牛血清（上海华 美生物技术有限公司）。96孔塑料培养板及100

7、mn培养皿（丹麦Nunc公司）。成纤维细胞培养10%、牛手术切取增生性瘢痕及正常皮肤组织，去皮下脂肪，新洁尔灭浸洗10min, PBS洗 3次，用组织剪将组织剪成细小碎块并接种于培养皿内，加少量血清的DME培养基，37C 5%CO静止培养，3天后补充少量培养剂，隔2天换液， 见有细胞从组织块爬出生长后每天换液，传代。CRT免疫细胞化学染色体外培养的成纤维细胞去培养基后，PBS轻洗，2%多聚甲醛固定10min, % 双氧水反应5min, PBS再洗；二抗血清37E20min,抗CRT抗体37E作用45min, HRP兔抗羊IgG37E反应1h, DAB显色；显微镜下观察显色信号。CRT原位 EL

8、ISA检测7选择第5代培养细胞为实验对象，用夷蛋白酶消化后收集细胞，调整细胞 浓度至106/ml，每孔100卩l接种于96孔培养板内。培养16h后，去培养剂，PBS清洗；2%多聚甲醛固定10min,液氧水反应5min, PBS洗; 与%Triton X-100 4E作用3min后，进一步分别与5%、牛血清（37E、20min）、 抗CRT抗体（37E、1h）、5%、牛血清PBS稀释的HRP兔抗羊lgG（37E、1h）反应;PBS青洗后加入OP底物液100卩I，作用30min后用50卩I1mol/L硫酸中止反应。 ELISA reader 上读取 492nm的 P 值。2结果成纤维细胞初代培养结

9、果在体外相同培养条件下，细小的瘢痕及正常皮肤组织块接种后 2天见有部 分贴壁，培养1周后有少量的成纤维细胞从组织块边缘爬出， 2周后细胞在组织 块周围呈晕状分布，此后细胞开始向外旺盛扩散增殖。显微镜下观察瘢痕及正常 皮肤组织来源的成纤维细胞形态，发现细胞均呈细小梭形状，二者未见明显差异。成纤维细胞CRT表达的免疫细胞化学染色结果原代培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞在未生长融合前，细胞内均有不同 程度的CRTffl性表达；一旦细胞生长融合后，在融合区内的成纤维细胞中均未见 有明显的CRTffl性信号出现，但在融合区边缘仍处于增殖、迁移扩散的瘢痕及正 常皮肤成纤维细胞内，则仍有 CRT勺阳性信号分布

10、；就二种细胞内CRT的表达信号强弱来看，瘢痕成纤维细胞内的CRT阳性信号相对较强，而正常皮肤成纤维 细胞内CRT阳性信号相对较弱；另外，当瘢痕及正常皮肤成纤维细胞以较高密度 传代培养时，细胞内CRT表达在接种后16h较为明显，而在培养24h细胞接近融 合时信号较弱。转此外，CRT在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达区域无明显差异，往往在细 胞浆、核膜及核内均有表达。成纤维细胞CRT表达的ELISA检测结果根据CRT免疫细胞化学染色结果，我们对第 5代瘢痕及正常皮肤成纤维细 胞(接种后培养16h)进行CRT表达的ELISA检测，其中正常皮肤成纤维细胞组的 CRT表达值为± (A)，瘢痕成

11、纤维细胞组为± (A)，二组间差异有非常著性意义(P V)。3讨论增生性瘢痕是伤口上皮化愈合后组织内成纤维细胞异常活化即继续旺盛增 殖并分泌大量胶原、纤维连接蛋白及蛋白多糖等细胞外间质所造成的一种组织病 理改变，有关瘢痕成纤维细胞为何异常活化一直是整形烧伤外科领域里重点探索 的课题之一。转化生长因子 P 1、肿瘤坏死因子a、白细胞介素-1和类胰岛素 生长因子-1等在增生性瘢痕组织内的过度表达一直被认为是引起成纤维细胞异 常活化不可忽视的因素，但越来越多实验研究表明瘢痕成纤维细胞自身生物学特 性改变是触发其功能异常的关键 8。我们通过对细胞内CRT的表达检测，进- 步发现CRT不但在瘢

12、痕成纤维细胞内分布广泛，而且其表达量明显高于正常皮肤 成纤维细胞内水平。CRT作为钙离子主要结合蛋白，早期研究认为 CRT主要是通过影响细胞内 钙离子的储存与释放而影响细胞的一些生物学活性效应，但近几年的研究结果表明CRT除上述作用外，它在细胞迁移扩散及细胞内相关基因表达等方面均有直接 的介导和调节作用。1997年，Zhu等人9通过对B16细胞CRT表达的深入研 究发现实细胞内的CRT分子常常与整合素粘附分子的 a链胞内区结合并成为双 向传导细胞内外信号的复合体；Coppolino等人5利用CRT缺乏而整合素表 达正常的胚胎干细胞进行细胞体外迁移粘附研究，证实在正常培养条件下干细胞 的迁移扩散

13、能力很弱，而经转染CRT基因后，细胞的迁移粘附作用显著增强。因 此，Coppolino认为细胞内CRT与整合素粘附分子直接参与细胞的信号传导、粘 附、迁移扩散等生物学活性功能。Tsai等10曾利用体外结缔组织收缩模型 发现增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞在体外有着比正常皮肤成纤维细胞更强 的迁移扩散能力，并认为其作用可能与细胞内肌动蛋白丝积聚有关。笔者在博士后研究工作阶段却发现在相同培养条件下增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞除 有着较强迁移扩散能力外，还具有高表达 P 1、a 1、a 2、a 3及a 4整合素粘 附分子的特性11,从而提示瘢痕成纤维细胞的强迁移扩散能力与高表达整合 素粘附分子有关；

14、而从本实验对CRT在瘢痕成纤维细胞内的表达情况来看， 细胞 内其CRT表达并不属持续性表达，CRT的高表达期一般是在细胞的迁移扩散阶段， 而当细胞融合后细胞内CRT表达甚少。但就与同一时期培养的正常皮肤成纤维细 胞相比，瘢痕成纤维细胞内的CRTS达则显得更为丰富。因此，结合我们以往的 研究工作结果，我们认为：瘢痕成纤维细胞异常的迁移扩散能力是细胞内丰富的 CRT整合素粘附分子表达及肌动蛋白丝积聚共同作用的结果，其中积聚的肌动 蛋白丝是其异常迁移扩散的重要动力来源，而有效表达的CRT及整合素粘附分子 则是细胞与细胞外间质之间迁移动力的传递媒介；另外，CRT的丰富表达对瘢痕成纤维细胞钙离子的储存、

15、释放及其信号传导等也有着重要的意义。参考文献1 Krause KH, Michalak Cell, 1997,88:4-443.2RD. Beta 2-microglobulindisulfideTector M, Zha ng Q, Salterxin can independen tlypro mote foldi ngandati on in class Ihist op atiblityp rote ins.and calnebond formMol Immunol,1997,34:401-408.3 Liu H,Bowes RC, van-de-Water B, et al. um

16、chaperones GRP78 and calreticulinEndopl asmic p reve ntoxidativereticulstress,cellsCa2+ disturba nces, and cell death in renal ep ithelialJ Biol Chem, 1997,272:21751-21759.4 Burns K, Op as M,MichalakM. Calreticulinin hibitsglucocorticoid-butnot cAMP-se nsitiveexp ressi onof tyros ineaminotran sferas

17、egene in cultrued McA-RH7777 hepatocytes. Mol Cell Biochem, 1997,171:37-43.5 CoppolinoMG, Woodside MJ, Demaurex N, et al. Calreticulinisesse ntialforin tegri n-mediatedcalcium sig nail ingand cell adhesio n. Nature, 1997,386:843-847.6 Eggleto nP, Reid KB, Kishore U, et al. Cli ni calreleva neeofcalr

18、eticuli nin systemic lupus erythematosus.Lup us,19976:564-571.7 Win isk A, Foster C. ICAM-1 exp ressi on in a spontan eouslytransformedhuman keratinocytecellline:Characterizationby asim piecell-ELISA assay. J In vestDermal, 1992,99:48-52.8 Tredget EE, Nedelec B,Scott -PG,et al.Hy pertro phicscarskeloids, and con tractures.The cellular and molecularbasisforthera py.Surg Clin North Am, 1997, 77:701-30.9 Zhu Q, Zeli nkaP,WhiteT, et al.Calreticuli n-i ntegri nidirect ionalsig nali ngplex.Biochem