浅谈结缔组织生长因子在病理性瘢痕中的表达

1、浅谈结缔组织生长因子在病理性瘢痕中的表达摘要： 目的 探讨结缔组织生长因子（CTGF在病理性瘢痕形成中的作 用。方法 采用半定量逆转录聚合酶链反应技术（RT-PCR检测10例瘢痕疙瘩（瘢 痕疙瘩组）和10例增生性瘢痕（增生性瘢痕组）中的 CTGF mRN的表达，并以 8例正常皮肤（正常皮肤组）作为对照。结果病理性瘢痕中CTGF mRN表达均明显高于正常皮肤组（P关键词：瘢痕疙瘩；增生性瘢痕；结缔组织生长因子瘢痕疙瘩和增生性瘢痕是临床常见的病理性瘢痕，也是整形外科较难解 决的临床问题，目前其发病机制尚不清楚。研究发现，病理性瘢痕是以成纤维细 胞为主的细胞成分过度增生以及以胶原为主的细胞外基质过度

2、沉积构成，当前普遍认为转化生长因子-P 1 （TGF-P 1）是促进纤维化的重要生长因子之一，在瘢 痕的形成过程中起着核心的作用1，而结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF） 是一种由成纤维细胞在 TGF-B 1刺激下产生的生长因子， 具有强烈的刺激成纤维细胞增殖和促进胶原沉积的作用，作为TGF-P 1的重要下 游介质2,在各种纤维化疾病中发挥着重要作用。我们应用RT-PCF技术在核酸水平检测CTGF在病理性瘢痕中的表达情况，探讨CTGF在瘢痕中的作用，为探 求病理性瘢痕的成因寻求一定的实验依据。1材料和方法标本来源和分组实验标本均来源于徐

3、州医学院附属医院整形外科，所有标本选取前均未进 行过任何放疗、药物注射、外用药物治疗。患者均无系统性疾病，瘢痕表面无破 溃、感染。分组：瘢痕疙瘩组10例，年龄842岁，平均岁。病变部位包括 胸前、上臂、耳垂、上背部。增生性瘢痕组10例，年龄336岁，平均岁。病变部位包括前胸、下腹、颈部、四肢。正常皮肤组8例，年龄650岁，平均岁。为其他整形手术切除的正常皮肤标本。标本采集切取标本时均在无菌条件下进行，去除皮下脂肪组织及表皮，放入事先标 记好序号的冻融管，立即投入液氮速冻，然后转移至-70C冰箱保存备用。试剂与设备TRNzol试剂（北京天根公司）;RNAPCR试剂盒（杭州博日科技有限公司）; 电

4、动匀浆器（美国Homogehizer公司）;Eppendorf-5840R 台式冷冻离心机（德国 Eppendorf公司）；PCR扩增仪PTC-100（美国MJResearch公司）；电脑三恒多用 电泳仪（北京六一仪器厂）；凝胶成像系统INGENIUS （美国基因有限公司）。实验方法引物准备参照人CTGF cDNZ序列，进行特异性CTGF引 I物设计，同时选取P -actin 作为内参照。CTGF序列：上游 5' -AAC TAT GAT TAG AGC CAA CTG CCT 33-, 下游 5' -TCA TGC CAT GTC TCC GTA CAT CTT C-,扩增片

5、段长度为 475 bp , P -actin :上游 5' -CCGCGAGAAGATGACCCAGAT-S，下游 5' -GAAGCATTT GCG GTG GAC GA-用这对引物可扩增 P -actin cDNA 片段长度为781 bp。引 物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。组织总RNA提取取标本组织50 mg剪碎后加入1 ml TRNzol试剂，电动组织匀浆器匀浆，其后操作步骤按照试剂说明书进行。抽提的总RNAM D260 nm和D280nm，并计算比值为，余下RNA加入30100卩I不含RNA酶的双蒸水,70E冰箱保 存备用。逆转录（RT反应总体积10卩I，

6、RNA模板1卩I （2 卩g）, RNA酶抑制剂 卩I，5X RT Buffer 2 卩I ,10 mmol/L dNTP 1 卩I ,随机引物 卩I，逆转录酶 卩I，不含 RNA酶的双蒸水 卩I。按以下条件进行逆转录反应：室温10 min，45E 45 min， 95E 5 min，4C 5 min。cDNA 20C保存或直接扩增。PCR扩增按以下条件配制反应液：10X PCR Buffer 卩I, 10 mmoI/L dNTP 混合物 卩I, 5 卩moI/L CTGF上游及下游特异性引物各 卩I,Tap mix DNA聚合酶 卩I， RT产物卩I,加不含RNA酶的双蒸水18卩I至总体积2

7、5卩I。按以下条件进行 PCR反应：94E预变性 3 min,然后 94E 30 s,65 E 30 s,72 E 7 min, 72E 5 min, 循环30次，末次延伸72E 5 min。结果分析取10卩I PCF产物经2%琼脂糖凝胶电泳（电压8 V/cm）,溴化乙啶（EB 染色，以P -actin为内参照，设定值为1,经凝胶成像分析系统分析其灰度值 并计算比值。统计学处理采用SPSS统计分析软件进行统计学处理，数据以±s表示，组间比较采用 单因素方差分析，采用q检验进行两两比较，PV为差异有显著性。2 结果PCR产物结果可见到位于781 bp和475电泳结果见图1。）的比较3组

8、PCF扩增产物经电泳分离并在紫外灯下观察， bp处各有1条特异性条带，与预期扩增片段长度相符。各组间CTGF mRN表达量（相对于 p -actin瘢痕疙瘩组与增生性瘢痕组 CTGFnRN表达量均明显高于正常皮肤组（P）， 而瘢痕疙瘩组表达量又高于增生性瘢痕组 （P）。见表1。表13组间CTGFmRNA表达量的比较（略）3讨论CTGF是 1991年Bradham等3用亲和色谱法在人体脐静脉内皮细胞 的条件培养基中发现的，是一种富含半胱氨酸的多肽。在其他种属的动物如猪、 牛、蛙等体内亦存在，在人体多种组织器官如心、肝、肾、动脉和脑中广泛存在。 内皮细胞、软骨细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞及某些肿瘤

9、细胞均可表达CTGF4。根据靶细胞的不同，CTGF可以发挥不同的作用：促进细胞外基质合成5;促进血管的形成6;促进细胞凋亡7;刺激成纤维细胞生长8。病理性瘢痕中CTGF高表达的意义人体皮肤成纤维细胞具有较强的 CTGF表达潜能，正常状态下不表达或表达 极少。CTGF乍为TGF-P 1的下游反应介质， 当应用TGF-B 1刺激后，CTGF表达 明显上调，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的成纤维细胞释放的CTGF可以在TGF-B 1刺激下表达增加150倍9。Igarashi等10和刘剑毅等11研究均发现 瘢痕疙瘩中有广泛分布的CTGF，瘢痕的增生程度越明显，CTGF勺表达程度越高。 本研究结果显示，普通瘢痕

10、纤维组织中 CTGF含量低于瘢痕疙瘩，而正常皮肤中 CTGF表达很少或不表达。由此可推测，病理性瘢痕形成过程中CTGF在 TGF-P 1的作用下高水平表达，进而翻译成蛋白质，刺激组织成纤维细胞增殖和以胶原为 主的细胞外基质的沉积，而增殖的成纤维细胞继续分泌CTGF从而促进瘢痕组织的不断增生。这一点也解释了临床上瘢痕疙瘩为什么可以持续生长，并能不断向周围正常组织扩展，同时也为从核酸和蛋白质水平治疗瘢痕提供了依据。CTGF在病理性瘢痕治疗中的展望增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的病因、发病机制到目前为止尚不清楚。以往的实 验研究表明，在各种纤维化的疾病中 TGF-B和CTGF都同步增高。TGF-B 直 以来被

11、认为是促进纤维化的重要生长因子，但是由于TGF- P生物学效应的多样 化，作用的靶细胞种类较多，除可促进纤维化外，尚参与机体的抗炎、调控细胞 分化、调节免疫等，如果阻断TGF- P的表达，将可能引起细胞生长失控、免疫失调、严重炎症等不良反应12。本研究结果表明，CTGF乍为TGF- p的下游 反应介质，在病理性瘢痕的形成中起到一个重要的促纤维化作用。相比之下，CTGF的作用较为单一，主要作用于成纤维细胞而不影响上皮细胞和免疫细胞13。如果可以单纯阻断CTGF的表达或抑制其生物活性，既可以减轻 TGF-p的促纤 维化作用，又可以保留TGF-p有利的抗炎、抗肿瘤和调节免疫作用，这将可能 成为一种安

12、全、高效且特异性强的抑制纤维化的方法，在将来的瘢痕防治中将会 发挥令人瞩目的作用。目前针对 CTGF为靶点治疗病理性瘢痕尚未见报道，如何 阻断CTGF的表达或抑制其生物活性，有待于进一步研究。【参考文献】1 Border WA,Noble NA. Transforming growth factor beta in tissue fibrosis J . N Engl J Med, 1994, 331 (19): 1286-1292.2 Fan WH,Kar no vsky MJ. In creased MMP-£xp ressi on in conn ectivetissue gr

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