分子生物学课程论文

1、 PCR技术发展与应用的研究进展王亚纯 09120103 摘要：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是最常用的分子生物学技术之一，通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增定量PCR技术是克服了原有的PCR技术存在的不足，能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等，快速PCR技术快速PCR在保证PCR反应特异性、灵敏性和保真度的前提下，在更短时间内完成对核酸分子的扩增mRNA 差异显示PCR技术是在基因转录水平上研究差异表达和性状差异的有效方法之一近年来已经开展了许多这三方面的研究工作，本文就定量PCR技术、快速PCR技术、mRNA差异显示PCR技

2、术作一综述，以便更好地理解及应用这项技术。关键字：定量PCR；荧光PCR；快速PCR；DNA聚合酶；mRNA差异显示PCR0 前言聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术由于PCR简便易行、灵敏度高等优点，该技术被广泛应用于基础研究。但是，由于传统的PCR技术不能准确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其在临床上的应用受到限制1。鉴于此，对PCR产物进行准确定量便成为迫切的需要。几经探索，先后出现了多种定量PCR (quantitative PCR，Q-PCR)方法，其中结果较为可靠的是竞争性PCR和荧光定量PCR(fluorescence

3、quantitative PCR，FQ-PCR)。随着生命科学和医学检测的不断发展，人们越来越希望在保证PCR反应特异性、灵敏性、保真度的同时，能够尽量缩短反应的时间，即实现快速PCR(Rapid PCR or Fast PCR)。快速PCR技术不仅可使样品在有限的时间内可以尽快得到扩增，而且可以显著增加可检测的样品数量，显然，在大批量样本检测和传染病快速诊断等方面将会有重要的应用前景。例如，快速PCR在临床检测中可大大加快疾病的诊断效率；在生物恐怖袭击时能有效帮助快速鉴定可疑物中有害生物的存在与否；同时，由于PCR已经渗入到现代生物学研究的各个方面，快速PCR的实现必然可以使许多科学研究工作

4、的进展显著加快，最终影响到整个生物学发展的速度。近年来，快速PCR技术得到了可喜的进展。从聚合酶的改进、添加剂的开发以及热循环仪的革新创造三个不同途径上分别进行的研发表明。生物的性状和生物对各种生物、理化及致病因子的应答，本质上都是基因在时间上或空间上选择性表达，即基因的差异表达的结果，因而，获取差异表达的基因信息，将有助于了解生物的生理变化和病理改变的分子机制2。研究基因差异表达主要技术有：消减文库筛选、差异杂交、代表性差异分析、基因表达序列分析、电子消减技术3和mRNA差异显示PCR技术等(mRNA Differential Display PCR，简称DD-PCR4 )。迄今为止，上面的

5、几种方法已成功地用于基因差异表达的研究。尤其是mRNA差异显示PCR技术，虽然发明只有短短十几年，已经取得了令人瞩目的科研成果，原因是它具备需要总RNA 的量极少，不需要纯化的mRNA，操作简便、快速、灵敏等优点5-8，故已被许多生命科学实验室作为一种重要工具，应用于体内和体外差异表达基因的筛选，研究基因功能9。现将定量PCR技术、快速PCR技术、mRNA差异显示PCR技术研究情况作一综述作简要综述。1 定量PCR技术定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监

6、测，进行PCR起始模板量的定量。狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型： （1）外参法+终产物分析，是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。 （2）内参法+终产物分析，是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。 （3）外标法+过程监测，这种类型监测扩增效率，阳

7、性样本定量准，但是无法排除假阴结果。（4）内参法+过程监测，由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参与物，存在竞争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。 （5）外标法+过程监测+内对照，这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。1.1 竞争性PCR技术定量PCR技术是对传统PCR技术的进一步发展和补充，在定量过程中需借助各种形式的参照物。参照物是一种已知含量的标准模板，按其是否与待测样品在同一反应体系中扩增而分为内参照和外参照。鉴于PCR扩增过程中管与管之间的扩增效率存在差异，理想的定量PCR应该使用内

8、参照。竞争性PCR即是采用内参照的一种定量PCR方法，通过消除管间及样品间的变异，从而达到较为精确的基因定量10。该方法是将待测基因与已知浓度的内参照模板在同一反应管中共同扩增，由于二者具有相同引物的结合位点并采用同一引物进行扩增，因此二者竞争引物、脱氧核苷酸以及DNA聚合酶，以致当一种模板量逐渐增加时，另一种模板的扩增产物就会逐渐减少。两模板的扩增产物量可分别用以下公式表示：Y待测= X待测(1+E)n；Y内参照= X内参照(1+E)n，其中X待测为起始拷贝量；Y待测为扩增产物量。由于在同一反应体系中扩增，两模板的循环次数n保持一致，如果使两者间的扩增效率E也相同，就存在如下关系：Y待测/Y

9、内参照= X待测/X内参照。当两模板的产物量相同时，则两模板的反应起始拷贝数相等，由此可对待测模板进行精确定量。具体检测方法是将已知浓度的内参照模板倍比稀释后分别与恒定量的待测基因一起扩增，以参照模板的起始拷贝数为横轴，以两模板扩增产物量的比率为纵轴，作出标准曲线，纵坐标为1的点所对应的参照模板的起始拷贝数即为待测基因的拷贝数。由上述定量原理可知，保持两模板扩增效率E的一致性是定量的关键，为此要求参照模板应与待测基因具有相似的大小及序列，相同的引物结合位点。此外，参照模板还应在扩增后易于分离检测。因此，对于竞争性PCR的研究重点主要集中在建立高效、稳定、可靠的模板方面，现已取得了较满意的结果1

10、1-13。1 2 荧光定量PCR技术荧光定量PCR（RQ-PCR技术）是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。Ct值( cycle threshold，Ct )，即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，即Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。1.2.1 Taqman技术Taqm

11、an 技术由美国PE公司开发，现已广泛用于基因检测。该技术的原理是利用Taq 酶的5-3外切酶活性，在传统PCR技术一对特异性引物的基础上增加了一条荧光双标记探针。该探针可与上、下游引物之间的DNA模板序列特异性结合。探针的5端标以荧光报告基团，如FAM(62羧基荧光素)；3端标以荧光淬灭基团，如TAMRA(62羧基四甲基诺丹明) 。当探针保持完整时，两个基团的空间距离非常接近，构成荧光能量传递( FRET) 关系，5端荧光报告基团发出的荧光信号被3端淬灭基团吸收，使其不能被仪器检测。当两个基团发生分离后，两者间的FRET关系被破坏，淬灭基团的抑制作用解除，报告基团的荧光信号便得到释放。在PC

12、R退火复性期，探针与DNA 模板特异性结合。在PCR延伸阶段，Taq酶在引物的引导下，以四种脱氧核苷酸为底物，按碱基配对原则沿着模板合成新链，当移动至探针结合的位置时便发挥其5-3外切酶活性将探针降解成单核苷酸，使得荧光报告基团与淬灭基团分离，前者的荧光信号释放并被检测。由此可见，每合成一条新链就有一个探针被裂解并释放出一个荧光信号。根据这种关系，通过检测PCR反应液中的荧光强度，再经校正计算后即可得出初始模板的数量。Taqman技术现主要用于病毒的定量分析，病原体的分型鉴定，基因的快速诊断分析14-16。1.2.2 AmpliSensor 技术该技术与Taqman PCR的区别在于其采用的是

13、复合探针。一个探针上标以荧光报告基团，另一个探针上标以荧光淬灭基团，后者的5端较前者多出7个碱基( GCGTCCC)。两探针之间能因碱基互补而结合，此时两基团靠近而形成FRET结构，报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收。当两探针分开后，其间的FRET关系受到破坏，淬灭基团的抑制作用解除，报告基团的荧光信号得到释放。在PCR扩增前需将该复合探针与一个半套式PCR引物连接，该引物的5端应具有一段与长探针上多出的7个碱基互补的序列，以便DNA连接酶能将该引物与短探针连接。扩增时该探针2引物复合物作为半套式引物掺入到模板，并释放出淬灭探针，使原有的FRET结构破坏，从而释放出报告基团的荧光信号，其强度与被

14、扩增的模板数相对应。Matera G等17用AmpliSensor技术对丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus HCV)的基因型进行检测，发现此方法具有很高的特异性，能准确检测待测标本中DNA的基因型和含量。1.2.3 Lightcycler技术Lightcycler技术是Roche公司新近开发的一种PCR定量技术。该技术的特点18,19也是将荧光报告基团和淬灭基团分别标记在两个不同的探针上，形成荧光探针和淬灭探针。荧光报告基团标于探针的5端，荧光淬灭基团标于探针的3端，两探针能分别与模板同一条链中相邻的核苷酸序列进行杂交。当探针游离时能检测到报告基团的荧光信号； 如果反应体系中存在特

15、异性模板，PCR复性阶段两探针即会与之杂交，此时两探针上的荧光报告基团和淬灭基团相距很近，形成FRET关系，前者的荧光信号被后者吸收，即发生荧光淬灭。由于荧光淬灭的程度与被扩增的模板量相对应，因此可达到定量的目的。Kearns AM等20,21报道，Light-cycler技术在对病毒DNA的快速分型和定量方面有特殊的优势。1.2.4 Molecular beacon技术亦称分子信标技术是一种单链DNA 形成的发夹结构， 在其一端有一报告基团， 在另一端有一淬灭基团， 当它形成发夹结构时， 由于荧光报告基团与淬灭基团想互靠近， 两者之间发生荧光信号能量共振转移( fluorescent res

16、onance energy transfer FRET)，当热循环温度达到分子beacon的解链温度时，其构象改变，与模板结合而完全伸展成线性分子，使得FRET消失，报告基团发出荧光信号。2 快速PCR技术随着生命科学和医学检测的不断发展，人们越来越希望在保证PCR反应特异性、灵敏性、保真度的同时，能够尽量缩短反应的时间，即实现快速PCR(Rapid PCR or Fast PCR)。快速PCR技术不仅可使样品在有限的时间内可以尽快得到扩增，而且可以显著增加可检测的样品数量，显然，在大批量样本检测和传染病快速诊断等方面将会有重要的应用前景。例如，快速PCR在临床检测中可大大加快疾病的诊断效率；

17、在生物恐怖袭击时能有效帮助快速鉴定可疑物中有害生物的存在与否；同时，由于PCR已经渗入到现代生物学研究的各个方面，快速PCR的实现必然可以使许多科学研究工作的进展显著加快，最终影响到整个生物学发展的速度。近年来，快速PCR技术得到了可喜的进展。从聚合酶的改进、添加剂的开发以及热循环仪的革新创造三个不同途径上分别进行的研发表明，快速PCR技术不仅对普通扩增，且对实时定量扩增都具有可实现性，并已有相关的部分试剂或仪器在市场上推出。从研发角度，目前技术的发展重点主要集中在热聚合酶融合蛋白及芯片式PCR仪的研制两个方面。21 快速PCR的实现途径快速PCR技术原理仍建立在常规PCR原理的基础上。常规的

18、PCR反应过程通常是三大阶段的循环，即变性阶段、退火阶段和延伸阶段(在某些情况下，退火阶段和延伸阶段可以合并)，反应时间是以上三个阶段的总时间加上各阶段间温度变化的时间。要实现快速PCR，其根本问题就是要缩短这三大阶段的持续时间或温度变化的时间。在PCR中，变性阶段的目的将双链DNA在高温下变性为单链DNA，所用时间取决于聚合酶的耐受温度，常用的聚合酶耐受95，若提高聚合酶的耐受温度，则变性阶段的时间可以缩短；退火阶段的目的是使单链DNA相互间正确配对形成双链DNA，主要取决于模板的复杂程度以及引物和模板之间的结合能力，要缩短这一阶段的持续时间可以通过加入一些稳定单链DNA形成或促进双链DNA

19、形成的添加剂来实现。而延伸阶段的持续时间主要取决于DNA聚合酶的延伸速率，可以通过发现新的高效DNA聚合酶、对现有DNA聚合酶的改进以及加入能增强酶活性的辅助因子等来获得更高的延伸速率，从而缩短延伸过程的时间。至于各阶段间温度变化的时间则主要取决于热循环仪的工作效率，可以通过选择传热性能更优良的材料、改进热循环仪的工作原理或采用微小体积反应等方式使PCR仪的传热效率提高，进而大大缩短温度变化所占用的时间，最终使整个反应的速率得到提高。2 2 用于实现快速PCR的DNA聚合酶在PCR循环中，延伸阶段的持续时间主要取决于DNA聚合酶的延伸速率，提高聚合酶的延伸活性和延伸速率无疑会缩短整个PCR反应

20、所需的时间。由于PCR反应常用的Taq、Pfu等DNA聚合酶在其天然的生物体中主要用于DNA损伤的修复以及重组等，因此它们的延伸活性和延伸速率比较低22。为了获得具有高延伸活性的热稳定DNA聚合酶，研究者通过基因工程的手段将DNA聚合酶与能和DNA链相互作用的蛋白质功能域以融合蛋白的形式相结合，或直接利用定点突变的方法筛选出具有高延伸活性的DNA聚合酶。Wang等22通过将蛋白Sso7d与DNA聚合酶融合得到了具有快速延伸能力的DNA聚合酶。Sso7d是从Sulfolobus solfataricus中分离到的一种双链DNA结合蛋白23。它大量存在于嗜热古细菌中，被认为在稳定基因组DNA中发挥

21、着重要的作用。研究表明，将Sso7d与A家族或B家族的DNA聚合酶以融合蛋白的形式连接在一起后，由于Sso7d对双链DNA具有一定的亲和力，可以识别退火后的双链，从而使聚合酶快速找到延伸起始点，有效地增强了原DNA聚合酶的延伸速度。例如，与Sso7d融合的Pfu DNA聚合酶可以在2min内延伸10k的DNA片段，而一般的PfuDNA聚合酶相同时间下即使提高酶的用量也只能合成2k的DNA片段。同时，融合后DNA聚合酶与双链DNA的作用是较弱的，这就避免了强相互作用所导致的阻碍DNA聚合酶在DNA链上移动的不利结果。此外还发现Sso7d可以增加聚合酶对体系中高盐浓度的耐受性，可便于对PCR反应进

22、一步优化。与Sso7d相类似，在DNA拓扑异构酶V中发现的螺旋O发夹O螺旋结构蛋白也是一种DNA非特异性结合蛋白24。它在中性pH的条件下部分带正电，因此可以与带负电的DNA磷酸骨架相互作用。Pavlov等25将它与PfuDNA聚合酶相融合后发现可以增加DNA聚合酶的热稳定性、提高酶对高盐浓度的耐受性，并增加酶的延伸活性。目前，商品化的快速PCR聚合酶主要是Takara公司的Taq聚合酶，该酶除了延伸速率提高之外，还可耐受更高的变性温度，推荐98变性1s，因此变性阶段的时间也缩短了不少。Machida等26在大批量样本的扩增中评价了快速Taq聚合酶，扩增产物正常，但未与其它常规用Taq酶比较。

23、在Qiu等27的工作中，评价了TaqDNA聚合酶、LA OTaqDNA聚合酶与AmpliTaqDNA聚合酶对PCR产物中嵌合体(chimeras)，突变(mutiation)和异源双链( heterodup lex)的产生的影响。在其试验体系中ZOTaq具有最高的反应速率，但形成PCR 假象( artifact)的总几率较高，达20%；LAOTaq具有最高的保真度，反应速率居中，形成PCR假象的总几率为15%；AmpliTaq形成PCR假象的几率为7%。ZOTaq (8. 7% )与LA OTaq ( 6. 2% )比Am pliTaq ( 2.5% )容易形成嵌合体。ZOTaq形成嵌合体和异

24、源双链的频率比AmpliTaq高几乎三倍。该工作提示利用ZOTaq酶快速扩增的同时部分程度上牺牲了保真度。3 mRNA 差异显示PCR技术31 mRNA差异显示PCR技术的主要原理在生命过程的某一时期，生物细胞转录和表达的基因只有很少一部分，而且在不同的发育阶段、不同的生理状态和不同类型细胞的基因转录和表达也不尽相同，因此，研究mRNA的差异，相对于研究DNA差异，排除了内含子的影响，使研究更接近于生命活动的实质。mRNA差异显示PCR技术是根据真核生物细胞中绝大多数mRNA均带有3polyA尾的结构特点(除极少部分mRNA，如组蛋白mRNA外) 。以此为依据，设计3端引物Oligo-dTnM

25、(M 分别代表A、C、G) ，这3种引物，称之为锚锭引物28-29。利用锚定引物将不同来源的细胞或不同生理状态的同种细胞的mRNA 逆转录为cDNA，并用此引物和5端的随机引物对逆转录产物PCR扩增，对PCR产物进行凝胶电泳，随后进行荧光染色或硝酸银染色或放射自显影，通过比较找出差异表达的cDNA条带30。从凝胶上切割下这些差异性条带，用相同的引物和条件进行PCR再扩增，克隆所得PCR产物进行核苷酸序列分析，将分析结果与基因序列数据库中的序列作同源比较，就可知分离的是已知基因序列，还是未知基因序列；同时分析结果可以用作探针从cDNA文库或基因组DNA文库中筛选到全长的cDNA序列或基因组克隆。

26、32 差异显示PCR技术应用中的优点321 极少的总RNA的需要量差异显示PCR技术总RNA需要量极少，一次试验仅需要0.20.02g，在这一点上，是其他的差异表达研究方法无法比拟的，这种方法使得尤其对材料来源困难的生物体的差异表达的研究得以实现5。同时用纯化的总RNA和纯化的mRNA做模板都可以获得相同差异表达结果，因为锚定引物Oligo-dTnM能特异性结合于mRNA的poly(A)尾部，而转运RNA和核糖体RNA的存在不影响差异显示PCR的结果31。3. 22 敏感度高其他研究差异表达的方法适用于高转录水平的mRNA的差异比较，而低转录水平的mRNA的差异比较却显得无能为力。差异显示PC

27、R技术对于筛选低转录水平的mRNA的结果得到很大改善，使低转录水平mRNA进行差异显示PCR的可能性大大提高32-33。321 操作简单快捷差异显示PCR技术操作简单快捷，从RNA的纯化，差异显示PCR、差异电泳、差异带分离纯化，差异鉴定、阳性结果的序列分析，整个可以在23周完成，这是其他方法无法比拟的6。33 差异显示PCR技术应用中的不足虽然差异显示PCR技术已广泛应用于差异表达基因的研究，并且仍在不断地优化和改进，但是，差异显示PCR技术在实际应用中仍存在一些问题31,34-35。331 假阳性高差异显示PCR技术假阳性差异带过高，差异显示PCR时的差异带往往不能在Northern杂交和

28、反向Northern杂交中重现。差异条带经回收后，必须再次扩增才能用于Northern杂交、克隆及序列分析等，有时2次PCR反应经常扩增出多条带，影响随后的杂交鉴定34。332 获得的片段短mRNA的平均长度1.2kb，差异显示PCR所得cDNA片段的长度多在100400bp之间，平均长度约300bp，这些片段大多数位于mRNA3端300bp左右的非翻译区，这段mRNA在不同生物间差别较大，基因文库中常不包括这部分。差异显示PCR的cDNA并不是都能找到与之同源的序列。另外，由于同一生物3端的非翻译区较为相似，对cDNA进行测序之后并不能预测其功能和作进一步的分析。为了得到翻译区的序列，常用的

29、方法是筛选cDNA文库或者应用RACE方法获取全基因，但筛选cDNA文库非常耗时，并且同一物种，不同的基因3端的非翻译区非常相似，筛库工作很可能是徒劳的35。333 稀有mRNA差异显示困难PCR高度灵敏，易扩增展示稀有mRNA片段，这既是该方法的优点，也是该方法的不足之处，因为稀有的mRNA在杂交时显示不出表达信号。因此，该方法倾向于分离高拷贝数的cDNA序列，如何提高分离稀有mRNA效率有待进一步的研究31。3 小结与展望基因分析的定量化是对基因诊断的要求和未来发展的趋势。总的来说，定量PCR技术的研究方兴未艾，还有诸多问题有待解决，如竞争性PCR中竞争性模板制备较难，且与待测模板的扩增效

30、率也难以达到完全相同；Taqman技术中Taq酶的外切酶活性能影响定量；AmpliSensor技术仍无法区分引物二聚体形成的非特异扩增信号，且每次PCR反应前需进行AmpliSensor标记，增加了操作步骤及成本；分子信标技术所用探针与模板结合的稳定性还不理想；以及Lightcycler技术因两个探针均与模板结合而影响了扩增效率等；此外，荧光定量PCR技术均存在探针标记的成本较高，不便普及的问题，分析灵敏度仍需不断提高。以上表明对定量PCR技术的研究还需不断深入。相信在不久的将来，会有结果更精确、成本更低的定量PCR技术出现，在实验研究及临床诊断上得到广泛的应用。PCR技术总体来讲已经成为一个

31、较为成熟的技术，但随着研究和应用领域不断增长的新需求，PCR仍存在相当巨大的改进空间。这其中，快速PCR技术的探索无疑是一项重要的拓展工作。如上所述，通过提高酶的活性、加入适合的添加剂以及对热循环仪中使用的温度改变方式进行改进，已经从不同程度上实现了快速PCR。如果能将三者的优势有机地结合起来，则扩增速度有望进一步提高我们认为，针对该技术的面向普及应用的评价仍需深入，在实际使用过程中也不能单纯盲目地求快，而应当根据研究对象的不同，在保证PCR反应的特异性、灵敏性以及高产量的情况下实现快速PCR。从目前的研究结果看，各种快速PCR试剂(包括酶，添加剂)在PCR反应的特异性、灵敏度、产量方面的系统

32、评价显然不够，应该引起研究者的重视。随着更多新方法的发明，随着各学科间交叉合作的深入，快速PCR技术会进一步完善和系统化，给所有生物学工作者带来新的惊喜。mRNA差异显示PCR是一种比较灵活、全面的检测细胞和组织差异表达基因的方法，该方法具有其他许多方法无法比拟的优点，但是也存在一些问题，近年来的科学研究针对一些问题已经做了改进，人们相信，随着时间的推移，该方法必然在促进差异基因的研究中作出更大贡献。参考文献：1 Chung HW. Reverse transcriptase PCR ( RT-PCR) and quantitative-competitive PCR(QC-PCR). Exp

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