含何首乌血清对人胚肺二倍体成纤维细胞端粒酶活性的影响(一)

1、含何首乌血清对人胚肺二倍体成纤维细胞端粒酶活性的影响(一)作者：李朝敢，韦星，农嵩，韦耀东，张树球【摘要】 目的 观察含何首乌血清对人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）超氧化物歧化酶(SOD)活性、c-myc mRNA表达及端粒活性的影响。方法 采用含何首乌血清对2BS细胞株进行处理，用黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性，RT-PCR检测c-myc mRNA表达，TRAP-ELISA检测端粒酶活性。结果 与正常对照组相比，用药组2BS细胞SOD活性明显增加（P0.05），c-myc mRNA表达无变化，端粒酶活性显著增加（P均0.05）。结论 含何首乌血清对2BS细胞具有抗衰老作用，其机理可能与促进自由

2、基的清除和激活端粒酶活性有关。 【关键词】 首乌；血清；药理学；人胚肺二倍成纤维细胞；超氧化物歧化酶；c-myc；端粒，末端转移酶Abstract: Objective To observe effects of Tuber Fleeceflower Root serum on activity of SOD, the expression of c-myc mRNA and the activity of telomerase of human fetal lung diploid fibroblasts (2BS). Methods 2BS cell lines were treated

3、with Tuber Fleeceflower Root serum. The activity of c-myc mRNA was detected by semi-quantitive RT-PCR. A TRAP-ELISA method was used to measure the telomerase activity. Results Compared with those in the control group, the activity of SOD increased obviously (P0.05), the expression of c-myc mRNA rema

4、ined on the same level, and the telomerae activity were enhanced significantly(P0.05) in the drug group. Conclusion Tuber Fleeceflower Root serum can postpone senescence of 2BS, its mechanism may be associated with enhancement elimination of free radicals and activation of telomerase. Key words: Tub

5、er Fleeceflower Root; srum; pharmacology; human fetal lung diploid fibroblasts; superoxide dismutase; c-myc; telomerase何首乌又称首乌、赤首乌、乌肝石等，为蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的块根，具有补肝肾、益筋血、壮筋骨、乌须发之功效。研究表明1，何首乌具有抗衰老、保护神经、增强免疫功能、降低血脂、抗动脉粥样硬化、抗心肌缺血、保肝、抗癌、抗菌等作用。在正常体细胞中，由于端粒的缩短及缺乏端粒酶的表达，细胞逐渐衰老。仅有极少数的细胞因为端

6、粒酶在某种因子的作用下偶然激活，持续合成端粒DNA序列使细胞绕过M2退化期，获得无限增殖能力，从而逃避了程序性老化。端粒酶活性的调节可为抗衰老的研究提供一条新途径2。本组研究何首乌血清药物对人胚肺二倍成纤维细胞（2BS）内超氧化物歧化酶(SOD)活性、c-myc表达及端粒酶活性的影响，以探讨其抗衰老的可能机理，为抗衰老药物的筛选及老年病的康复提供用药实验依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞株 2BS由北京生物制品研究所提供的25代细胞系，以30代龄以下为年轻细胞，50代龄以上为老年细胞。1.1.2 主要试剂和仪器 胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品，

7、SOD检测试剂由南京建成生物技术有限公司提供，Trizol试剂盒为美国Invitrogen公司产品，RT-PCR试剂盒为Promega公司产品，PCR引物为上海生物工程公司合成，Telomerase PCR-ELISA试剂盒为德国Boehringer Mannheim公司产品。KHB K3酶标仪(芬兰)，2700型PCR仪（ABI公司，USA）。1.2 方法1.2.1 含药血清制备3 取健康家兔6只(由右江民族医学院动物实验中心提供)，随机分为空白对照组和用药组。用药组每天灌胃何首乌水煎剂（含生药）4.5g/kg，空白对照组灌胃蒸馏水，连续灌胃5天，采血前24h禁食，采血前再灌胃1次，每只家兔

8、采血于无菌离心管中离心10min(3000r/min)，无菌分离血清，56灭活30min，过滤除菌，冻存备用。1.2.2 细胞培养及分组 将2BS细胞于25ml培养瓶中培养，以含100u/ml青霉素、100g/ml链霉素、10% FBS的RPMI 1640培养液在37、5%CO2的培养箱中培养。细胞分组为：年轻组、空白血清对照组(简称对照组)和含何首乌药物血清组(简称用药组)。年轻组从25代开始用10% FBS的RPMI 1640培养液培养，传代至30代时收集细胞；取生长状态良好的35代细胞，消化传代，待细胞贴壁后，吸弃含FBS的培养液，换10%含药血清培养液，即含药血清组，同时换空白血清做对

9、照，传代至51代后，收集细胞。1.2.3 SOD活性测定 分别收集各组细胞，调整细胞数为1106/ml，细胞反复冻融，使细胞胀破，离心取上清液用黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性，于550nm处测OD值。实验过程参照检测试剂盒说明书。1.2.4 半定量RT-PCR检测基因表达 离心收集各组细胞，按Trizol试剂盒的说明书提取总RNA。内对照-actin和c-myc引物借助primer premier 5.0软件设计，并经Genebank验证。-actin引物：上游5-ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG-3，下游5-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3，扩增

10、产物长度621bp；c-myc引物：上游5-CCA ACA GGA GCT ATG ACC TC-3，下游5-CTC GGT CAC CAT CTC CAG CT-3，扩增产物为290bp片段。按试剂盒说明采用一步法进行RT-PCR。RT-PCR反应体系总体积50l，逆转录4545min，禽成髓性白血病病毒逆转录酶（AMV RT）灭活和预变性942min，然后进行PCR 35个循环（9430s，571min，682min），最后延伸687min，终止于4。各取PCR产物10l，加溴酚蓝指示剂2l，于1.5%琼脂糖凝胶上电泳约1h（电压90V），用紫外透射分析仪观察结果。通过密度扫描仪扫描分析各

11、条带的光密度，以-actin的表达量为对照计算并比较各组c-myc的相对表达量。实验重复3次。1.2.5 端粒酶活性检测 离心收集各组细胞。制备端粒酶抽提液和端粒重复序列扩增法-酶联免疫吸附试验（TRAP-ELISA）操作按照试剂盒说明书进行。以690nm作为参比波长，测定样品在450nm波长的吸光度(A)，吸光度差值A=A450nm-A690nm，A值代表细胞端粒酶活性。1.2.6 统计方法 计量数据以s表示，用SPSS11.5软件进行统计学分析，参数统计采用t检验。2 结果2.1 各组2BS细胞SOD活性的检测结果 年轻组2BS细胞SOD活性明显高于对照组（P0.05），用药组2BS细胞S

12、OD活性明显高于对照组（P0.001），见表1。表1 各组2BS细胞SOD活性比较（略）注:与对照组比较,a:t=4.093,P0.05；b:t=8.122,P0.0012.2 各组2BS细胞c-myc mRNA的表达 各组2BS细胞c-myc mRNA相对表达量无明显变化（P0.05），见图1和表2。2.3 各组2BS细胞端粒酶活性的比较 年轻组2BS细胞端粒酶活性与对照组无明显变化（P0.05），用药组2BS细胞端粒酶活性明显高于对照组（P0.001），见表2。3 讨论何首乌主要含有蒽醌类化合物、二苯乙烯苷类化合物及聚合原花青素等，此外何首乌中还含有大量的卵磷脂和多种微量元素。二苯乙烯苷是

13、何首乌的主要活性成分4。何首乌能延长二倍体细胞的生长周期；可明显降低老年小鼠脑和肝组织中丙二醛(MDA)含量，增加脑内单胺类递质水平，增加SOD 活性，还能明显抑制老年小鼠脑和肝组织内单胺氧化酶-B的活性，从而消除自由基对机体的损伤，延缓衰老和疾病的发生；能明显提高老年大鼠的外周淋巴细胞DNA损伤修复能力，调节中枢神经活动，延缓大脑的衰老57。图1 RT-PCR检测c-myc基因mRNA表达（略）M. DNA marker 1.年轻组 2.用药组 3.对照组表2 各组2BS细胞c-myc mRNA表达和端粒酶活性比较（略）注:与对照组比较,a:t=2.157,b:t=0.512,c:t=1.3

14、11,P均0.05；d:t=12.082,P0.001有关衰老的自由基学说认为，衰老是自由基(主要是氧自由基) 对细胞成分的有害攻击造成，维持体内适当水平的抗氧化和自由基清除水平可以推迟衰老。正常情况下，体内有多种清除氧自由基的酶，能清除代谢过程中产生的氧自由基，主要有超氧化物歧化酶(SOD)，以及过氧化氢酶和过氧化物酶8。在本实验中用药组2BS细胞SOD含量高于对照组，表明何首乌药物血清在一定程度上促进细胞SOD的合成（或者是SOD的激活剂），从而使细胞增加抗自由基能力，延缓衰老过程。研究表明，端粒和端粒酶在细胞复制性衰老中起着重要作用。端粒是真核细胞染色体末端的重复DNA序列，其生物学作用

15、是防止染色体DNA降解、末端融合、非正常重组和染色体的缺失。由于存在“末端复制问题”，随着细胞老化，人体细胞端粒重复序列长度不断缩短，端粒缩短到一定长度，细胞就会停止分裂而走向衰老死亡。但端粒酶能够由自身的RNA提供模板，来维持与染色体稳定至关重要的端粒结构，使细胞具有无限繁殖的能力。如果在正常体细胞中重建端粒酶活性，就可维持细胞的端粒长度，延缓细胞的衰老9。端粒酶再激活被认为是细胞逃脱衰老的重要机制。本实验结果数据显示，用药组2BS细胞端粒酶活性明显高于对照组，提示何首乌药物血清通过激活端粒酶活性，维持细胞端粒长度或引起端粒缩短减慢，从而延缓细胞的衰老。目前对端粒酶的激活途径还不完全清楚，从

16、现有资料看，端粒酶的激活是一个多因子参与的多水平的调节过程，涉及转录水平调控、蛋白质之间的相互作用以及蛋白质的磷酸化。其中myc构成了端粒酶激活途径的核心。研究发现10，myc激活端粒酶的确是通过上调端粒酶的催化亚单位TERT的mRNA表达水平来实现的。在原代培养的无端粒酶活性的乳腺上皮细胞和成纤维细胞中发现myc基因的表达产物可直接激活端粒酶，其活性可以达到肿瘤细胞中的水平。本实验结果发现，年轻组、用药组和对照组2BS细胞c-myc mRNA表达无明显变化，表明含何首乌血清激活端粒酶活性不是通过c-myc激活途径。本实验结果证实：含何首乌药物血清对2BS细胞具有抗衰老作用，其机理可能与促进自

17、由基的清除和激活端粒酶活性有关。但其确切机理有待进一步研究。【参考文献】1 孙桂波,纪凤兰,徐惠波,等.何首乌的化学成分与药理作用研究进展J.长春中医药大学学报,2007,23(4):105-106.2 宋昊岚.端粒酶与衰老及肿瘤J.肿瘤研究与临床，2000，12（1）：67-68.3 王筠，张军平.中药血清药理学实验方法研究概况J.天津中医药，2005，22（1）：86-88.4 孙桂波，纪凤兰，徐惠波，等.何首乌的化学成分与药理作用研究进展J.长春中医药大学学报，2007，23(4)：105-106.5 陈计，夏炎兴，杨秋美，等.何首乌吸收成分对大鼠二倍体细胞生长和传代的影响J.上海中医药杂志，1995，29(8)：41-42.6 杨秀伟.何首乌醇提物对易老化小鼠肝脏和脑单胺氧化酶活性的影响J.中国中药杂志，1996，21（1）：48-49.7 宋士军，李芳芳，岳华.何首乌的抗衰老作用研究J.河北医科大学学报，2003，24（2）：90-91.8 黄丹.细胞衰老的研究进展J.暨南大学学报：医学版，2001，22（6）：36-39.9 Granger MP, Wright WE, Shay JW.