突变型人胰岛素原基因的克隆及其腺病毒载体的构建

1、突变型人胰岛素原基因的克隆及其腺病毒载体的构建         【摘要】  目的: 构建含有定点突变的人胰岛素原基因的腺病毒表达载体。方法: 首先利用RTPCR 方法从正常流产胎儿胰腺组织获取野生型人胰岛素原cDNA; 然后通过重叠延伸PCR方法在人胰岛素原cDNA 上产生2个突变位点, 使突变的cDNA编码的蛋白质含弗林蛋白酶的识别位点, 该突变型胰岛素原cDNA片段命名为INSM2; 最后将INSM2亚克隆至腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆位点上, 并与骨架载体共转染至细菌内, 通过细菌内同源重组得到

2、重组载体。结果: Hind 和Xho I 酶切、 Pac I酶切及测序均证实载体pAdINSM2构建成功。结论: 构建的含定点突变人胰岛素原基因腺病毒载体pAdINSM2为进一步转染非胰岛细胞, 对糖尿病进行基因治疗奠定了基础。 【关键词】  胰岛素原 腺病毒载体/pAdEasy1 弗林蛋白酶糖尿病已成为仅次于心脑血管病症和癌症的第三大致死疾病, 胰岛素是治疗糖尿病的主要药物, 但由于随时需要注射胰岛素,  给患者带来了极大的不便, 对糖尿病的基因治疗成为了可能。随着分子生物学领域取得的迅猛发展, 特别是重组DNA 技术的建立1, 我们通过重叠延伸PCR技术对胰岛素原基因进

3、行2个位点的突变, 将人胰岛素原基因cDNA 上BC链连接处的碱基序列Lys Thr Arg Arg 及CA链连接处的Leu Gln Lys Arg分别突变为Arg Thr Lys Arg及Arg Gln Lys Arg序列, 以使其可以被弗林蛋白酶识别2。然后将突变型的人胰岛素原基因构建到腺病毒载体中, 使其有望成为糖尿病基因治疗理想的候选载体之一, 并为进一步进行人胰岛素原基因转染非胰岛细胞, 使之产生胰岛素治疗糖尿病奠定基础。1  材料和方法11  材料 PCR产物胶回收试剂盒、 限制性内切酶Hind 、  Xho I、  Probest

4、 DNA聚合酶、 Simple T Vector、 DNA marker均购于大连宝生物公司;  T4 DNA 连接酶、 MMLV逆转录酶购于Invitrogen公司;  限制性内切酶Pme I、 Pac I购于NEB公司;  质粒DNA 抽提试剂盒购于赛百盛;  引物由上海生物工程有限公司合成;   pAdEasy1载体系统、 DH5菌株、 BJ5183菌均由血研所中法实验室保存。12  方法121  引物设计根据GenBank发表的人胰岛素原基因cDNA序列, 综合利用Primer5和Oligo6引物设计软件设

5、计人胰岛素原基因全长的引物, INS1: 5GCT  CTC GAG  GCC ACC ATG GCC CTG TGG AT3;  INS2: 5GAG  AAG CTT  GCT GCG TCT AGT TGC AGT AGT3, 划线部分为酶切位点（Xho I 和Hind III）。再根据PCR定点突变原理, 分别在人胰岛素原基因BC链及CA链连接处进行2次突变, 突变引物设计如下:  INS3: 5TTC TTC TAC ACA CCC CGG ACC CGC3;  INS4: 5GCG GGT CCG GGG TGT

6、 GTA GAA GAA3;  INS5: 5GTC CCG GCA GAA GCG TGG CAT TGT3;  INS6: 5ACA ATG CCA CGC TTC TGC CGG GAC3;  斜粗体划线部分为突变的位点。122  野生型人胰岛素原基因的获得 取胎龄5个月的经水囊引产的健康胎儿胰腺组织, 液氮中冷冻过后用DEPC处理过的研钵研磨, 然后加入TRIzol抽提总RNA, 以提取的总RNA经逆转录后合成的cDNA为模板, 以引物INS1和INS2进行PCR反应。反应条件: 94, 预变性5 min;  变性、退火及延伸

7、条件分别是94 30 s, 60 30 s, 72 30 s, 共进行30次循环;  最后72延伸10 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。将PCR 产物克隆至T载体上进行筛选、 扩增及鉴定, 并送测序公司测序。         123  突变型人胰岛素原基因的获得 采用重叠延伸PCR 法, 使人胰岛素原基因产生两处突变。以获得的野生型人胰岛素原基因为模板, 首先进行B链/C肽连接处的突变。用引物INS1、 INS4和引物INS3、 INS2分别扩增出两段PCR产物,

8、利用引物INS3和INS4的互补部分使这两段PCR产物互为模板和引物, 在DNA聚合酶的作用下延伸出整条人胰岛素原基因, 然后再加入引物INS1和INS2继续扩增含有第一个突变的人胰岛素原基因（命名为INSM1）, 将扩增产物连接到T载体中, 并送测序公司测序鉴定。第二处突变在C肽与A链的连接处。以经测序第一处突变改造成功的人胰岛素原基因为模板, 用引物INS1、 INS6和引物INS5、 INS2经过以上同样的方法诱导产生含有第二个突变的人胰岛素原基因（命名为INSM2）, 将扩增产物连接到T载体中送测序公司测序鉴定。124  穿梭腺病毒载体的构建 将腺病毒穿梭质粒pAd

9、trackCMV和突变型人胰岛素原基因（INSM2）分别用Hind 和Xho双酶切, 纯化、 回收双酶切产物进行连接, 连接反应条件为INSM2双酶切产物5 L、  pAdtrackCMV双酶切产物3 L、  Buffer  1 L、  T4 DNA连接酶1 L,  16  16  h, 连接产物命名为pAdtrackINSM2, 转化DH5感受态细胞, 铺板、  挑菌、 摇菌、 提取质粒,  Hind 、 Xho酶切鉴定。125  重组腺病毒载体的构建 先把BJ5183细菌用氯化钙法

10、制备成感受态, 将腺病毒骨架质粒pAdEasy1转化到BJ5183感受态细胞中, 铺板、 挑菌、 摇菌后再用同样的方法制备成感受态细胞。然后pAdtrackINSM2被限制性内切酶Pme线性化, 再经碱性磷酸酶CIAP处理后, 转化入含有腺病毒骨架质粒pAdEasy1的BJ5183感受态细胞中去同源重组。经过铺板、 挑菌、 摇菌、 提取质粒等步骤获得重组质粒pAdINSM2。经Hind 、  Xho和Pac酶切鉴定。2  结果21  野生型人胰岛素原基因的扩增利用设计的人INS的特异性引物, 以正常流产胎儿胰腺组织总RNA为模板, 采用RTPCR的方法, 扩增出人

11、INS全长的cDNA片段, 片段大小与预期结果一致（图1）。22  人胰岛素原基因的定点突变  采用重叠延伸PCR 法, 以获得的野生型人胰岛素原基因为模板, 用引物INS1、 INS2、 INS3、 INS4扩增得到2个PCR产物（PCR1和PCR2）, 将两段PCR产物连接, 使其在B链/C肽连接处产生2个碱基的突变, 得到INSM1（图2）。将其连接到T载体上并转化到DH5中, 经测序鉴定位点突变成功。再以INSM1为模板, 用引物INS1、 INS2、 INS5、 INS6扩增得到另两段PCR产物（PCR3和PCR4）,同样将两段PCR产物连接, 使其又在C肽/A链

12、连接处产生一个碱基的突变, 得到INSM2（图2）。将其连接到T载体上并转化到DH5中, 经测序鉴定位点突变成功。23  穿梭腺病毒载体的构建 胶回收Hind /Xho双酶切的腺病毒穿梭质粒pAdtrackCMV和含突变型人胰岛素原基因的T载体（INSM2T）, 连接后产物命名为pAdtrackINSM2, 转化DH5感受态细胞后提取质粒, 经Hind 、  Xho酶切鉴定与预期结果一致（图3）。24  重组腺病毒载体的构建 通过氯化钙化学转化法将质粒pAdEasy1转化于BJ 5183菌后, 抽提质粒后电泳鉴定, 与原来的pAdEasy1质粒

13、大小一致。pAdtrackINSM2质粒线性化后也通过氯化钙转化法转化于含pAdEasy1的BJ 5183感受态细胞, 小量抽提质粒, 经PCR及Pac I酶切的方法鉴定为含有INSM2基因的阳性克隆。其中, 经Pac I酶切产生一个大约35 000 bp的大片段和一个约4 500 bp的小片段,  经PCR可检测到约400 bp左右的INSM2基因的插入（图4）。3  讨论   胰岛素作为糖尿病的特效药用于临床已有70多年的历史。但从目前看来多次注射胰岛素、 胰腺移植、 胰岛细胞移植等都存在各种弊端3, 4,  随着基因重组和转基因技术的发展

14、, 使基因治疗糖尿病成为可能5。研究发现6, 只有胰岛细胞含有特定前激素转化酶(PC2和PC3), 可以把人胰岛素原合成为成熟的具有生理活性的胰岛素A链和B链复合体。而非细胞不含这类酶, 但在大多数非细胞内普遍表达furin蛋白酶, 它的底物是Arg Thr Lys Arg 或Arg Gln Lys Arg。所以我们将人胰岛素原基因cDNA 上BC 链连接处的碱基序列Lys Thr Arg Arg 及CA 链连接处的Leu Gln Lys Arg 分别突变为Arg Thr Lys Arg 及Arg Gln Lys Arg 序列, 使其成为furin蛋白酶的底物, 从而使非细胞在转染突变后的人胰

15、岛素原基因后, 能够合成成熟胰岛素并分泌到细胞外, 发挥生理功能。   在基因治疗研究中, 病毒载体是比较常用的载体。在众多的病毒载体中, 腺病毒因其: (1)既可以感染分裂期, 又可以感染非分裂期细胞;  (2)外源基因表达水平高;  (3)病毒滴度高, 制备纯化相对容易;  (4)插入外源基因容量大;  (5)病毒基因组较少发生重排等五大优点而倍受关注。特别是一些人腺病毒和动物腺病毒载体的构建成功及其在临床上的成功应用,  使得腺病毒作为载体的研究受到普遍的重视7, 8。我们的实验选取了pAdEasy1腺病毒载体系统, 首先将我们的目的基因连接到它的穿梭载体中, 经过线性化之后, 用碱性磷酸酶（CIAP）处理线性化的穿梭载体, 然后再去与骨架载体重组, 最终成功构建了腺病毒载体。我们的实验构建含有定点突变的人胰岛素原基因的腺病毒表达载体, 为进一步进行胰岛素基因转染非胰岛细胞, 使之产生胰岛素治疗糖尿病奠定基础。【参考文献】  1袁凤山